Terapia Genica

1. Terapia Genica

2. Terapia cellulare • Allotrapianto:cellule provenienti da un donatore della stessa specie • Autotrapianto:cellule provenienti dallo stesso paziente • Xenotrapianto:cellule provenienti da animali di specie diverse

3. Strategie terapeutiche genetico-molecolari • Produzione di proteine normali in diversi sistemi di espressione (batteri, lieviti, cellule in coltura, animali geneticamente modificati). • Produzione di anticorpi geneticamente modificati. • Produzione di vaccini geneticamente modificati. • Terapia genica.

4. Terapia genica Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Può essere in vivo o ex vivo

5. Vantaggi teorici della terapia genica • Correzione radicale dei difetti • Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici • Vantaggi economici (se è permanente eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti)

6. Possibili limitazioni della terapia genica • Mancanza di necessità per disponibilità di terapie alternative • Mancanza di efficacia • Grandi problemi tecnici • Costi • Effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)

7. Attuali problemi tecnici della terapia genica • Efficienza di trasferimento (vettori virali migliori di non virali) • Selettività del sistema di trasferimento • Espressione instabile nel tempo • Espressione non regolata • Reazioni del sistema immunitario • Problemi etici

8. Quando si può pensare di curare una malattia con la terapia genica? • Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti potenzialmente reversibili. • Gene clonato. • Disponibile sistema di trasferimento genico efficiente per le cellule affette, che garantisca espressione stabile nel tempo. • Non richiesta regolazione precisa del gene in questione.

9. Strategie terapeutiche Incremento della dose genica Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzione totale o parziale di un gene (ad esempio patologie autosomiche recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)

10. Strategie terapeutiche Correzione mirata della mutazione genica Necessaria per le patologie causate dalla presenza di un prodotto genico alterato, che agisce attraverso un meccanismo dominante o dominante-negativo. Efficace anche nel caso di una perdita di funzione.

11. Strategie terapeutiche Inibizione mirata dell’espressione genica Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo.

12. Strategie terapeutiche Inibizione mirata dell’espressione genica RNAi

13. Inibizione mirata dell’espressione genica RNA-interference RNAi

14. Inibizione mirata dell’espressione genica Ribozimi RNAi

15. Strategie terapeutiche Uccisione diretta di cellule patologiche

16. Strategie terapeutiche Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario

17. Come faccio entrare il DNA nelle cellule, e cosa gli succede quando è entrato? Vettori non virali Vettori virali Integrazione casuale Integrazione sito-secifica

18. Vantaggi dei vettori virali • Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali • Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite • Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) • Molecole di DNA di dimensioni limitate • Reazioni immunitarie • Costi elevati

19. Vantaggi dei vettori non virali • Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni • Riduzione del rischio di reazione immunitaria • Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi • Bassi costi di produzione • Possibilità di produzione in grandi quantità Svantaggi dei vettori non virali • Scarsa efficienza • Se si usano molecole di DNA a doppio filamento anche questi vettori ossono dare mutagenesi inserzionale

20. Vettori non virali Liposomi

21. Vettori non virali Endocitosi mediata da recettore

22. Vettori non virali Elettroporazione e altri metodi fisici (shotgun)

23. Cosa si può far entrare nelle cellule con vettori non virali • Plasmidi • Molecole di DNA a doppio filamento lineari • Oligonucleotidi DNA • Oligonucleotidi RNA (varie modificazioni chimiche, come i gruppi morfolino) • Ribozimi • Polipeptidi

24. Vettori virali • In tutti i casi si tratta di virus difettivi, che possono essere prodotti solo grazie a particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. In ogni caso la loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate: • Costruzione del genoma ricombinante • Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali • Raccolta e analisi del virus • Trattamento del paziente

25. Vettori virali: caratteristiche principali • Retrovirus :possono infettare solo di cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale. • Lentivirus :derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. • Adenovirus:esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. • Virus adeno-associati (AAV):integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. • Herpes simplex:infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici.

26. Retrovirus • Enveloped virus • RNA genome (2 copies) • dsDNA enters into the nucleus and integrates upon mitosis • Enters the cell by fusion • LTR: viral transcription, polyad., replication, integration

27. Vettori retrovirali amphotropic encapsidation cell line Gag Pol Env Psi - LTR Gag Pol Env LTR Psi - ecotropic-MoMulv ADA Psi + LTR plasmid transfection

28. Trial clinico per deficit ADA

29. Retrovirus Trial on 2 ADA patients. Started 1990. 2 years treatment.Results published in 1995 Science, Blaese et al

30. Retrovirus Ex-vivo Retrovirus-med. gene therapy:SCIDXI trial 1998, A. Fisher France • Recessive disease • X linked • Defect in the gc gene, receptor for cytokines => block in T and NK differentiation • Ex-vivo gene therapy on CD34+cells: MuLV- gc 20x106 cells/Kg

31. Retrovirus A. PCR: detection of gc DNA B: RT PCR Detection of gc RNA protein expression Lymphocyte subsets

32. Retrovirus • Genoma di RNA singolo filamento. • Possono infettare solo cellule proliferanti • Integrazione casuale nel genoma. • Difficle produrli in grandi quantità (titolo elevato). • Successo della terapia dipendente dalla trasduzione delle stem cells. • Poco immunogeni. • L’espressione può andare incontro ad attenuazione nonostante la persistenza del virus nel genoma. • In assoluto sono vettori più utilizzati per la terapia genica.

33. Come infettare le cellule post-mitotiche? Lentivirus (HIV-1) Oncoretrovirus X • Nuclear transport • dependent • Int (MA, Vpr) • cPPT-DNA flap Mitosis- dependent ?

34. Lentivirus (HIV) • Genoma complesso: • geni strutturali gag pol env • geni regolatori tat rev • geni accessori nef vpr vpu vif • Tropismo per linfociti e macrofagi • Infezione persistente / malattia cronica progressiva

35. Lentivirus • Particelle virali ibride difettive per la replicazionecostituite da: • Un set minimo di proteine del core derivate da HIV-1 • Il pericapside di un virus non correlato (VSV or MLV) • Un genoma contenente: • una cassetta di espressione per il transgene • affiancata da sequenze cis-regolatorie di HIV-1 • non sono presenti geni virali

36. Costrutto di trasferimento GA RRE cPPT PROMOTORE TRANSGENE RSV GA RRE GFP PROMOTER  SD SA sequenze attivein cis LTR LTR U RRE Provirus HIV-1 GAG VIF ENV  POL R PRO TAT NEF NEF REV SD sequenze attive in trans Costrutto d’incapsidazione CMV GAG polyA RRE  PRO POL TAT SD REV Lentivirus: costruzione

37. GAG REV CMV CMV RRE polyA POL PRO RSV Costrutti d’incapsidazione SD SA Costrutto codificante il pericapside CMV VSV-G CMV polyA polyA SD SA Costrutto di trasferimento SIN (Self-inactivating) GA RRE cPPT hPGK eGFP Wpre GA RRE RSV PROMOTER GFP  SD SA Vettore lentivirale di ultima generazione

38. polyA VSV-G CMV GAG SD SA GA RRE cPPT eGFP Wpre hPGK RSV polyA Envelope GA RRE CMV RRE PROMOTER  PRO POL  TAT SD SA REV SD SA Costrutto di trasferimento Costrutto di incapsidazione Trasfezione transiente Cellule 293T Concentrazione per ultracentrifugazione Titolazione per diluizioni seriali Cellule HeLa Produzione del vettore Raccolta a 24 e 48 ore

39. Lentivirus GFP expression 3 months after injection

40. Lentivirus Control ALB promoter CMV promoter

41. Lentivirus • Genoma ad RNA. • A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. • Integrazione casuale (mutagenesi inserzionale) • Scarsissime reazioni immunologiche. • Elevata efficienza di trasduzione. • Ottime prospettive per la terapia genica in vivo.

42. Adenovirus

43. Adenovirus

44. Adenovirus MLP Late genes (L1-L5) E1 E3 VA ITR ITR 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 IVa2 E4 (E2F.RE)2 E2 3.6 kb E1 mediated regulation E4 mediated regulation E2 mediated regulation

45. Vettori adenovirali Late genes (L1-L5) MLP E1 Transgene E3 VA ITR 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ITR E4 E2 3.6 kb E1 293 cells ITR

46. Vettori adenovirali Sviluppo di nuove generazioni di vettori allo scopo di riudrre immunogenicità e aumentare le dimensioni degli inserti.

47. Adenovirus • Genoma di DNA doppio filamento. • Possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. • Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Pertanto non determinano mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti. • Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato). • Forti reazioni immunologiche.

48. Ciclo vitale degli AAV Fase latente Fase litica Ad Ad Integrazione sito-specifica Replicazione

49. AAV ITR ITR Rep Cap Integration Packaging Rescue DNA replication Capsid proteins VP1, VP2, VP3 Integration Rescue

50. AAV, preparazione