DNS marķieri ģenētiskās daudzveidības noteikšanā

1. DNS marķieri ģenētiskās daudzveidības noteikšanā Karina Latiševa kl08161

2. Ģenētiskā daudzveidība svarīga: • lai saglabātu spēju vairoties, izturību pret slimībām un spēju pielāgoties mainīgiem apstākļiem • nodrošina rezervi selekcijai, veidojot jaunas kultūraugu un mājdzīvnieku šķirnes http://flora.coa.gov.tw/graph/web_structure/222/222_01.jpg

3. Molekulārāis marķieris Jebkurš DNS molekulas fragments, lokalizēts noteikta vietā un saistīts ar noteiktu pazīmi Būtiska nozīme selekcijā: Sākot no atbildīgo par noteiktu pazīmi gēnu identifikācijas līdz sugu identifikācijai un ģenētiskas daudzveidības noteikšanai

4. Sadalījums Biežāk pielietojamas marķieru sistēmas var sadalīt uz: • PCR balstītām sistēmām (PCR-based) • hibridizāciju balstītām sistēmām (non-PCR or hybridization based)

5. Uz hibridizācijas balstītās sistēmas RFLP(Restriction fragment length polymorphism) irpirmāizstradātāpolimorfufragmentuidentifikācijasmetode • Balstās uz DNS šķelšanu ar restrikcijas enzīmiem un hibridizāciju ar iezimētām zondēm • RFLP sistēmas ir +salīdzinošilēta, kodominanta -irnepieciešamsaugstaskvalitātesDNS

6. Uz PCR balstītās sistēmas AFLP(Amplified fragment length polymorphism) • Balstāsuz selektīvu restrikcijas fragmenta PCR amplifikāciju • 3 soļi: 1.DNS restrikcija 2.selektīva restrikcijas fragment amplifikācija 3.analīze elektroforēzes gēlā • AFLP metode ir + ātra, lēta, variabila - dominanta

7. Uz PCR balstītās sistēmas RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) • Balstāsuz PCR reakciju, izmantojot īsus sintētiskus praimerus. Amplificētai DNS sekvencei ir gadījuma raksturs + ātraun ērtadažādusugupolimorfismaanalīzei, izmantojotidentiskuspraimerus; lēta - dominanta, jūtīga, zema precizitāte, ir nepieciešama labas kvalitātes DNS

8. Uz PCR balstītās sistēmas • SSRs (simple sequence repeat)/STRs(short tandem repeat)/mikrosatelīti • Sastāv no īsiem nukleotīdu motīvu atkārtojumiem 1-6 bp (piem., CACACACACACACACA) + hipervariabli, polimorfi, plaši izplatīti genomā, kodominanti - salīdzinoši dārga

9. Retrotranspozoni • Retrotranspozoni – I klases mobilie ģenētiskie elementi • Plaši izplatītas eukariotiskā genomā • Pārvietojās “copy-paste” transpozīcijas veidā • Parāda lielu insercijas polimorfismu Divas apakšklasēs: LTR-retrotransposons non-LTRretrotransposons LTR (long terminal repeat) Garie terminālie atkārtojumi Nekodē olbaltumvielas, bet satur retrotranspozona gēnu transkripciju regulējošos promotorus un terminatorus. http://www.sisef.it/iforest/contents/?id=ifor0501-002

10. Retrotranspozoni • Plaši izplatītas eukariotiskā genomā • Satur domēnus, no kurām ir iespējms konstruēt praimerus PCR rekcijai • Pārvietojās “copy-paste” transpozīcijas veidā • Parāda lielu insercijas polimorfismu Piemēroti marķieru sistēmas izstradāšanai Plaši pielieto ģenētiskas daudzveidības pētījumos

11. S-SAP(Sequence-Specific Amplified Polymorphism) • Amplificē DNS fragmentu, ierobežoto ar retrotranspozonu specifisku praimeri un restrikcijas vietu DNS sekvencē Pirmo reizi pielietota miežu daudzveidības analīzei http://www.nature.com/hdy/journal/v106/n4/fig_tab/hdy201093f2.html

12. IRAP(Inter-retrotransposon amplified polymorphism) • Amplificē DNS fragmentu starp diviem retrotranspozoniem http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/images/remaps.jpg

13. REMAP(Retrotransposon-microsatellite amlified polymorphism) • DNS fragments tiek amplificēts starp mikrosatelīta (SSR-simple sequence repeat) sekvenci un retrotranspozonu http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/images/remaps.jpg

14. iPBS(interPrimerBindingSite) • Balstīta uz PCR amplifikāciju, par praimeriizmantojot LTR retrotranspozonu praimerapiesaistes vietu (PBS) Nepieciešami pretējā virziena orientēti LTR retrotranspozoni Nepieciešams tikai VIENS praimeris The iPBS method scheme (Kalendar et al., 2010).

15. iPBS for direct display of polymorphism Augi Ābols (Malus domestica) Kukurūza (Zea mays) Kartupeļi(Solanum tuberosum) Lini (Linum usitatissimum) (Kalendar et al., 2010).

16. iPBS for polymorphism detection in plant regenerants from tissue culture Retrotransposoni bieži tiek aktivēti ar audu kultūrām – kallusu veidošanu (Kalendar et al., 2010). http://www.plantcafeusa.com/All_Website_Pictures/3794988811_ac8a8539a7.jpg

17. Fingerprinting of animal samples iPBS metode tika pārbaudīti dzīvnieku šķirņu izpētē: govs, mājas vista, aita, jaks (Kalendar et al., 2010).

18. iPBS metode kaņepju daudzveidības noteikšanā • PCR produktu gēla elektroforēze • 1,7% agarozes gēls • Kopējais elektroforēzes ilgums – 18 stundas pie 43 V

19. Izmantotā literatūra • Kalendar R., Antonius K., Smykal P., Schulman A.H. 2010. iPBS: a universal method for DNA fingerprinting and retrotransposon isolation. Theor Appl Genet, 121 (8): 1419-1430. • Kumar A., Bennetzen J.L. 1999. Plant retrotransposons . Annu. Rev. Genet. 33: 479–532. • Schulman A.H., 2007. Molecular markers to assess genetic diversity. Euphytica 158: 313-321.

20. Paldies par uzmanību!

21. Jautājums • Kāpēc iPBS metodē ir nepieciešams tikai viens praimeris?