Wielowymiarowe widma NMR – nowe koncepcje i perspektywy

1. Wielowymiarowe widma NMR – nowe koncepcje i perspektywy Wiktor Koźmiński Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego

2. Zastosowania wielowymiarowego NMR • chemia: 2D NMR rutynowe pomiary : COSY, NOESY, ROESY, HSQC, HMBC, itd. • biomolekuły 2D, 3D, 4D dobrze zdefiniowane wąskie zakresy spektralne • widma wielowymiarowe (2D, 3D) są też coraz bardziej popularne w badaniach fazy stałej • MRI – te same metody (2D, 3D), ale próbkowanie przestrzeni odwrotnejgradientami B0

3. Co dają widma wielowymiarowe? • poprawa separacji sygnałów • poprawa czułości przy pośredniej detekcji jąder o niskim g • identyfikacja jąder wzajemnie oddziałujących • problem podstawowy: przypisanie sygnałów odpowiednim atomom • pośredni pomiar widm wielokwantowych • obrazowanie (MRI)

4. jednowymiarowe widmo NMR białka

5. widmo dwuwymiarowe

6. i trójwymiarowe HNCACB

7. t N t i exc mix i N–1 Problemy rosną z liczbą wymiarów czyli : • ograniczenia związane z próbką (nieistotne w większości przypadków) - stężenie, g, B0, T, własności relaksacyjne • i próbkowaniem (metodologiczne) • liczba punktów (ewolucji w wymiarach pośrednich) szybko rośnie z liczbą wymiarów • rozdzielczość jest proporcjonalna do maksymalnego czasu ewolucji (teoremat Nyquista) N – wymiarowy eksperyment : W przypadku MRI zmiana amplitudy PFG zamiast czasu Dlanipunktów w wymiarze i : n1n2 .... nN-12N-1 pomiarów 1D

8. … i oczekiwaną rozdzielczością • rozdzielczość jest ograniczona przez maksymalny osiągnięty czas ewolucji (tak naprawdę fazę f= wt) • maksymalny odstęp między punktami pomiarowymi – Df ≤ p(teoremat Nyquista)

9. próbkowanie aliasing t-1 t identyczne kopie widma Ograniczenie czasu pomiaru poszerzenie Splot sygnału NMR z funkcją próbkowania i ograniczeniem czasu ewolucji

10. W praktyce 2D: • liczba pomiarów 1D n2D= (t1max  sw1 + 1)  2 przykład (500 MHz) t1max=0.05 s, sw1=3.5 kHz (1H 7ppm) lub 20 kHz (13C 160 ppm) rozdzielczość 20 Hz n2D= 352 (1H) lub 2002 (13C) czas pomiaru (2 akumulacje po 2 s): 24’ (1H) lub 2 h 13’ (13C)

11. i 3D • liczba pomiarów 1D n2D= (t1max  sw1 + 1) (t2max  sw2 + 1)  4 przykład (500 MHz) t1max=t2max=0.05 s, sw1=3.5 kHz (1H) sw2= 20 kHz (13C) rozdzielczość 20  20 Hz n3D= 2818816 czas pomiaru (2 akumulacje po 2 s): ~4 miesiące

12. wpływ indukcji B0 • wraz z wielkością B0 rośnie czułość: S/N~B01.5 • ale zakresy spektralne także rosną z proporcjonalnie do B0 • przykład: 500 MHz  700 MHz aby uzyskać tę samą rozdzielczość w : widmach 2D czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5) widmach 3D dwukrotnie (7/5)2

13. wpływ indukcji B0 • wraz z wielkością B0 rośnie czułość: S/N~B01.5 • ale zakresy spektralne także rosną z proporcjonalnie do B0 • przykład: 500 MHz 700 MHz aby uzyskać tę samą rozdzielczość w : widmach 2D czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5) widmach 3D dwukrotnie (7/5)2

14. wpływ indukcji B0 • wraz z wielkością B0 rośnie czułość: S/N~B01.5 • ale zakresy spektralne także rosną z proporcjonalnie do B0 • przykład: 500 MHz 700 MHz aby uzyskać tę samą rozdzielczość w : widmach 2D czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5) widmach 3D dwukrotnie (7/5)2

15. Widma o zredukowanej wymiarowości ND  2D (próbkowanie radialne) zawodzi przy dużej liczbie sygnałów Koźmiński & Zhukov, Kim & Szyperski Rekonstrukcja z projekcji (też próbkowanie radialne) Kupče & Freeman Kodowanie przestrzenne – pomiary jednoprzebiegowe (EPI) Frydman et al. Spektroskopia kowariancyjna (naprawdę korelacyjna) Brüschweiler Metody niefourierowskie (MEM, MDD) Billeter, Orekhov, Hoch Wielowymiarowa transformata Fouriera (dowolne próbkowanie) nasza grupa Jak obejść problem próbkowania? czyli metody spektroskopii projekcyjnej oraz:

16. Widma o zredukowanej wymiarowości ND  2D (próbkowanie radialne) zawodzi przy dużej liczbie sygnałów Koźmiński & Zhukov, Kim & Szyperski Rekonstrukcja z projekcji (też próbkowanie radialne) Kupče & Freeman Kodowanie przestrzenne – pomiary jednoprzebiegowe (EPI) Frydman et al. Spektroskopia kowariancyjna (naprawdę korelacyjna) Brüschweiler Metody niefourierowskie (MEM, MDD) Billeter, Orekhov, Hoch Wielowymiarowa transformata Fouriera (dowolne próbkowanie) nasza grupa Jak obejść problem próbkowania? czyli metody spektroskopii projekcyjnej oraz:

17. spektroskopia NMR a obrazowanie • w przypadku spektroskopowym częstości w widmach NMR wynikają z różnych oddziaływań chmury elektronowej z jednorodnym polem B0, oraz wartości współczynników żyromagnetycznych g dla różnych jąder. • w eksperymencie obrazowania częstości rezonansowe różnicuje się geometrycznie zmieniając przestrzenny rozkład indukcji magnetycznej. w(x,y,z)=g(B0+xGx+yGy+zGz) • w spektroskopii konieczne jest przeniesienie koherencji pomiędzy jądrami (tego samego rodzaju – homojądrowe lub różnych rodzajów - heterojądrowe) np. CP, INEPT itd. W poszczególnych wymiarach obserwuje się rożne częstości dla tych samych cząsteczek. • w obrazowaniu ten efekt uzyskuje się przełączając kierunek gradientu indukcji B0.

18. spektroskopia NMR a obrazowanie • w przypadku spektroskopowym zróżnicowanie częstości w widmach NMR wynika z różnych oddziaływań chmury elektronowej z jednorodnym polem B0, oraz wartości współczynników żyromagnetycznych g dla różnych jąder. • w eksperymencie obrazowania częstości rezonansowe różnicuje się geometrycznie zmieniając przestrzenny rozkład indukcji magnetycznej. w(x,y,z)=g(B0+xGx+yGy+zGz) • w spektroskopii konieczne jest przeniesienie koherencji pomiędzy jądrami (tego samego rodzaju – homojądrowe lub różnych rodzajów - heterojądrowe) np. CP, INEPT itd. W poszczególnych wymiarach obserwuje się rożne częstości dla tych samych cząsteczek. • w obrazowaniu ten efekt uzyskuje się przełączając kierunek gradientu indukcji B0.

19. spektroskopia NMR a obrazowanie • w przypadku spektroskopowym częstości w widmach NMR wynikają z różnych oddziaływań chmury elektronowej z jednorodnym polem B0, oraz wartości współczynników żyromagnetycznych g dla różnych jąder. • w eksperymencie obrazowania częstości rezonansowe różnicuje się geometrycznie zmieniając przestrzenny rozkład indukcji magnetycznej. w(x,y,z)=g(B0+xGx+yGy+zGz) • w spektroskopii konieczne jest przeniesienie koherencji pomiędzy jądrami (tego samego rodzaju – homojądrowe lub różnych rodzajów - heterojądrowe) np. CP, INEPT itd. W poszczególnych wymiarach obserwuje się rożne częstości dla tych samych cząsteczek. • w obrazowaniu ten efekt uzyskuje się przełączając kierunek gradientu indukcji B0.

20. spektroskopia NMR a obrazowanie • w przypadku spektroskopowym częstości w widmach NMR wynikają z różnych oddziaływań chmury elektronowej z jednorodnym polem B0, oraz wartości współczynników żyromagnetycznych g dla różnych jąder. • w eksperymencie obrazowania częstości rezonansowe różnicuje się geometrycznie zmieniając przestrzenny rozkład indukcji magnetycznej. w(x,y,z)=g(B0+xGx+yGy+zGz) • w spektroskopii konieczne jest przeniesienie koherencji pomiędzy jądrami (tego samego rodzaju – homojądrowe lub różnych rodzajów - heterojądrowe) np. CP, INEPT itd. W poszczególnych wymiarach obserwuje się rożne częstości dla tych samych cząsteczek. • w obrazowaniu taki efekt uzyskuje się przełączając kierunek gradientu indukcji B0.

21. spektroskopia NMR a obrazowanie • w widmach NMR informacja jest rozproszona i zawarta w sygnałach  im więcej wymiarów tym sygnały są rzadsze  można otrzymać pełną informację z małej ilości danych • w obrazowaniu istotne jest wszystko  jest znacznie trudniej stosować metody przyspieszania pomiaru

22. Accordion spectroscopy i przesunięcia chemiczne:Próbkowanie radialne t1 i t2 w widmie trójwymiarowym • Pomiar punktów wzdłuż promienia r pod kątem j t2=r cos(j), t1=r sin(j) • Po jednowymiarowej transformacie Fouriera względem r uzyskuje się widmo z kombinacją liniową częstości : • wr= cos(j) w2 + sin(j) w1 • Niezbędne wyznaczenie znaków częstości • Analiza bezpośrednia – obliczanie częstości  „Reduced Dimesionality” • Widmo próbkowane wzdłuż promienia jest rzutem widma trójwymiarowego na płaszczyznę nachyloną pod kątem j rekonstrukcja z projekcji

23. Widma o zredukowanej wymiarowości – czyli rekonstrukcja z pojedynczej projekcji • Dla każdego sygnału trzeba rozwiązać układ równań liniowych, tj. trzeba zbadać różne kombinacje znaków częstości: wr=  cos(j) w2 sin(j) w1 • Zawodzi gdy liczba sygnałów jest zbyt duża np. dla wielowymiarowych eksperymentów NOE dla biomolekuł  potrzebna jest metoda pozwalająca odtworzyć widmo o wysokiej wymiarowości

24. Prosty przykład 4D → 2D HACANH j1= x/y, j2= x/y,(G1,y)/(-G1,-y) Koźmiński & Zhukov, J. Biomol. NMR, 26, 157 (2003)

25. HACANH +++ +–– +–+ ++–

26. Rekonstrukcja z projekcji • częstości w widmach 2D z próbkowaniem czasu wzdłuż r pod kątemj : • w2 cos(j) + w1 sin(j) Efekt: • projekcjawidma 3D na płaszczyznę nachyloną pod kątemj. • konieczne jest wyznaczenie znaków wszystkich częstości • oryginalny pomysł - obrazowanie: • Lauterbur, Nature, 242, 190 (1973)

27. Rekonstrukcja z projekcjiKupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003) F3 (1H) • jeśliczęstości F3nie są zdegenerowane wystarczą dwie płaszczyzny : • F1F3i F2F3 F2 (15N) F1 (13C)

28. Rekonstrukcja z projekcjiKupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003) F3 (1H) • jeśliczęstości F3nie są zdegenerowane wystarczą dwie płaszczyzny : • F1F3i F2F3 F2 (15N) F1 (13C) • F1F3 t2 =0j= 0o

29. F3 (1H) F2 (15N) F1 (13C) Rekonstrukcja z projekcjiKupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003) • jeśliczęstości F3nie są zdegenerowane wystarczą dwie płaszczyzny : • F1F3i F2F3 • w praktyce potrzeba wiele • otrzymuje się prawdziwe widmo trójwymiarowe • F1F3 t2 =0j= 0o • F2F3t1 =0j= 90o

30. F3 (1H) j F2 (15N) F1 (13C) kolejne projekcje pomagają usunąć niejednoznaczności

31. Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003)13C,15N-ubikwityna rekonstrukcjakonwencjonalne dwie płaszczyzny F3 (1H) =7.28 ppm F3 (1H) =8.31 ppm trzy płaszczyzny F3 (1H) =8.77 ppm

32. rekonstrukcja • zaleta : „prawdziwe” widma wielowymiarowe • wady: • artefakty, które mogą tworzyć fałszywe sygnały • zafałszowane kształty sygnałów • zafałszowane stosunki intensywności • wiele różnych podejść (deterministycznych i statystycznych) do rekonstrukcji widm • jak dotąd żadna nie jest całkowicie wolna od wad i ogólna

33. Transformacja Fouriera- najlepsza estymata sygnałów okresowych Podejście konwencjonalne sekwencyjna jednowymiarowa FT: • punkty przestrzeni czasu w rzędach i kolumnach • algorytm FFT

34. Problem: • teoremat Nyquista: Δt<1/sw • rozdzielczość: Δn1/at • dla danego czasu pomiaru konieczny kompromis między zakresami częstości a rozdzielczością • czas pomiaru rośnie w postępie geometrycznym z liczbą wymiarów

35. Aliasing przez równoodległe punkty można przeprowadzić więcej niż jedną sinusoidę but only one fits to randomly distributed points

36. Aliasing przez równoodległe punkty można przeprowadzić więcej niż jedną sinusoidę ale tylko jedna pasuje gdy punkty rozłożone są losowo

37. Aliasing przez równoodległe punkty można przeprowadzić więcej niż jedną sinusoidę ale tylko jedna pasuje gdy punkty rozłożone są losowo Wciąż obserwuje się aliasing powodowany zaokrąglaniem losowych współrzędnych czasu i/lub wielkością kroku zegara spektrometru. Jest to jednak nie znaczące – n.p. 12.5 ns cykl zegara daje MHz okno spektralne wolne od aliasingu.

38. FT i aliasing próbkowanie próbkowanie konwencjonalnelosowe 64 punkty 128 punktów 256 punktów 512 punktów tmax=1s 1024 punkty

39. FT i aliasing próbkowanie próbkowanie konwencjonalnelosowe 64 punkty 128 punktów 256 punktów 512 punktów tmax=1s 1024 punkty

40. próbkowanie losowe 2D - symulacja • próbkowanie losowebrak aliasingu! • można osiągnąć większe czasu ewolucji (i poprawić rozdzielczość) bez przedłużania eksperymentu!

41. jak to osiągnąć: • wielowymiarowa transformacja Fouriera w jednym kroku: • przemienna algebraClifforda: etc.

42. 400 MHz 3D HNCA ubikwityny 512 punktówKazimierczuk, Zawadzka, Koźmiński, Zhukov J Biomol NMR,36, 157 (2006) konwencjonalne losowe w3(1H) = 8.10 ppm w3(1H) = 8.74 ppm

43. Rezultat: brak aliasingu szerokość linii zdeterminowana relaksacją poprzeczną brak dodatkowych parametrów artefakty – o amplitudzie proporcjonalnej do pierwiastka kwadratowego z liczby punktów

44. schematy próbkowania • widmo 3D HNCACB dla różnych rozkładów

45. stosunek sygnałów do artefaktów (S/A) nie zależy od gestości próbkowania i wymiarowości eksperymentu • S/A jest proporcjonalny do pierwiastka kwadratowego z liczby punktów • można mierzyć widma o dowolnie wysokiej wymiarowości z rozdzielczością ograniczoną jedynie procesami relaksacyjnymi

46. Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowaniaK. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009) symulacje 1D - 250 punktów różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78 tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7

47. Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowaniaK. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009) symulacje 1D - 250 punktów różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78 tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7

48. Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowaniaK. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009) symulacje 1D - 250 punktów różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78 tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7

49. Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowaniaK. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009) symulacje 1D - 250 punktów różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78 tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7

50. Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowaniaK. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009) symulacje 1D - 250 punktów różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78 tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 miesiąc, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7