Manipulace a úpravy nukleových kyselin

1. Manipulace a úpravy nukleových kyselin

2. Metody fragmentace DNA

3. Z hlediska metod molekulární biologie jsou významné dva typy fragmentace DNA – sekvenčně specifická a nespecifická. První typ je zajišťován výhradně pomocí enzymů, tzv. restrikčních endonukleáz (zkráceně restriktáz). Nespecifická fragmentace bývá enzymová nebo mechanická.

4. Co jsou restrikční endonukleázy a kde se vzaly??? Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. modifikačních systémů, kterými jsou vybaveny hlavně některé druhy prokaryotických buněk. Každý systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit. První aktivita, restrikční, katalyzuje štěpení dvojřetězcové DNA. Druhá, metylační, modifikuje sekvenci rozeznávanou restriktázou a chrání ji proti štěpení. Modifikační aktivita chrání před degradací buněčnou DNA, zatímco cizorodá DNA, která vstoupí do buňky, může být degradována dříve než jsou metylázou rozeznávané sekvence modifikovány. Z hlediska genomických a diagnostických metod jsou využívány zejména restriktázy typu II. Tyto enzymy nenesou modifikační aktivitu (je zajišťována jiným enzymem), nevyžadují ATP a štěpí dsDNA v oblasti rozeznávaného místa (tzv. restrikčního místa anebo v jeho blízkosti). Rozeznávané sekvence sestávají obvykle ze 4 až 6 bp a jejich schematický záznam se vyznačuje dvojčetnou osou symetrie. Restrikčně-modifikační systém bakterií 1970(Smith & Wilcox) izolace první restrikční endonukleasy - HindIII

5. 5' A C T G T A C T A T G G A T C C AA T A C G T C A G T C 3' 3 ' T G A C A T G A T A C C T A G G TT A T G C A G T C A G 5' Palidromatická sekvence Bacillusamyloliquefaciens H– BamH I Restrikční endonukleázy, RE (restriktázy) • součástí RM systémů typu II u bakterií • rozeznávají a štěpí palindromatické sekvence DNA 5' A C T G T A C T A T G G A T C C AA T A C G T C A G T C 3' 3 ' T G A C A T G A T A C C T A G G TT A T G C A G T C A G 5'

6. V součastnosti je známo cca 3 000 restriktáz 5´přesahující konec G/GATCC 3´přesahující konec GGTAC/C tupé konce CCC/GGG http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

7. Star activity aneb hvězdičková aktivita * Příklad: Eco RI* Hvězdičková aktivita restrikčních endonukleáz j jev, který byl zaznamenán u řady enzymů této skupiny. Projevuje se zejména za extrémních podmínek výrazně odchylných od podmínek optimálních u normálních nepoškozených molekul enzymů, anebo u molekul pozměněných (po projití záruční doby, anebo v důsledku nevhodného skladování). Hvězdičková aktivita se projevuje zejména za těchto okolností: • Při vysoké koncentraci glycerolu • Při vysoké koncentraci enzymu • Při nízkých iontových silách • Při vysokých hodnotách pH • V přítomnosti některých organických látek (DMSO, etanol, etylenglykol, dimetlyformamid) !Pozor!

8. Restrikční endonukleázy (restriktázy) Endonukleáza je enzym štěpící nukleovou kyselinu uvnitř řetězce dsDNA. Restrikční endonukleáza neštěpí DNA kdekoliv, ale rozpoznává  určitou sekvenci bazí. Tak např. známý enzym Eco RI štěpí sekvenci G+AATTC v místě křížku. Z měna jediné báze vede ke zrušení cílového místa, DNA zde nebude štěpena. Napíšeme cílovou sekvenci pro Eco RI ve dvouřetězcové formě: G+AATTC CTTAA+G Vidíme, že sekvence je středově symetrická (tzv. palindrom: zleva čteme GAATTC, zprava GAATTC). Tato symetrie umožňuje rozštěpení druhého řetězce DNA ve vzdálenosti pouhých čtyř bazí od protilehlého zlomu. Tak dojde k úplnému přestřižení dvoušroubovice DNA. Cílové místo pro restriktázu rozpoznávající šestici nukleotidů se nachází podle počtu pravděpodobnosti průměrně jednou ve 4096 bazích - (1/4)6 = 1/4096. Ve skutečnosti mohou být dvě cílová  místa vzdálena 10 bp (párů bazí) i 10 000 bp. Rozložení cílových míst pro soubor restrikčních enzymů znázorňují restrikční mapy. Je zřejmé, že dvě molekuly DNA s totožnou sekvencí bazí budou mít i totožnou restrikční mapu. Naprostá shoda v restrikční mapě však neznamená zcela shodnou sekvenci obou DNA. K záměně bazí mohlo dojít v oblasti, kde není žádné cílové místo. Na základě restrikčních map lze učinit závěry o homologii srovnávaných sekvencí DNA. Čím více restrikčních enzymů k mapování použijeme, tím bude mapa podrobnější a tím přesnější bude i naše stanovení homologie srovnávaných sekvencí. V současné době je k dispozici asi 400 různých restrikčních enzymů rozpoznávajících přes 100 různých cílových míst. Některé restriktázy rozpoznávají totéž cílové místo – těm říkáme izoschizomery. Mohou se lišit v hodnotách optimálních reakčních podmínek (pH, teplota, koncentrace Mg apod.) i ve stabilitě své aktivity. Restrikční enzymy jsou produkovány bakteriemi, kterým slouží k ochraně před bakteriofágy. Rozštípou kteroukoli cizorodou DNA, tedy i DNA fága. Svou vlastní DNA si bakterie chrání metylací některých bazí v cílové sekvenci. U eukaryot nebyly typické restrikční enzymy nalezeny. Název restriktáz je odvozen z rodového a druhového jména bakterie, u které byl objeven. Tak např. Eco RI byl nalezen u Escherichia coli, Bgl I a Bgl II u Bacillusglobigii apod. Tyto restrikční enzymy rozpoznávají šestici bazí, v anglické literatuře se jim říká  „six cutters“. Druhou velkou skupinu tvoří „four cutters“, jsou to restriktázy rozpoznávající cílovou sekvenci dlouhou čtyři báze.

9. A jak restriktázy využívá rostlinolékařská diagnostika???Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP), polymorfizmus délky restrikčních fragmentů,kombinace se Southern blotem

10. RFLP: pro a proti • kodominantní markery • dobrá reprodukovatelnost • nutno předem charakterizovat všechny markery, t.j. zpravidla je klonovat • jen málo genů vykazuje RFLP polymorfismus • drahé a rel. pomalé

11. Gelová elektroforéza definovaně štěpené genomické DNA, pak navazuje Southern Blot

12. Další vybrané manipulace a úpravy vzniklých fragmentů DNA Klenowův fragment DNA polymerázy I T4 DNA polymeráza T7 DNA polymeráza Terminální (deoxy)nukleotidyltransferáza Alkalická fosfatáza Polynukleotid kináza DNázy

13. DNA polymeráza I z E. coli Aktivity: 5' -> 3' DNA polymeráza 3' -> 5' exonukleáza 5' -> 3' exonukleázu

14. Klenowův fragment DNA polymerázy I 5' -> 3' DNA polymeráza 3' -> 5' exonukleáza nemá 5' -> 3' exonukleázu, takže nemůže označit oblasti utajených přerušení 1. Doplňování 5´P přesahujících konců značení 3-OH konce Ale když nedáme do směsi prekurzory (dNTP), tak pouze odstraní 3-OH přesahující konec.

15. T4 DNA polymeráza - 5' -> 3' DNA polymeráza - 3' -> 5' exonukleáza (200x větší aktivita než Klenow) - nemá 5' -> 3' exonukleázu T7 DNA polymeráza • - 5' -> 3' DNA polymeráza • - 3' -> 5' exonukleáza • nemá 5' -> 3' exonukleázu • velká procesivita – po odstranění 3' -> 5' exonukleázy • se využívá pro sekvenování

16. Vybrané termostabilní DNA dependentní DNA polymerasy Termostabilní polymerasy se využívají zejména v souvislosti s PCR, proto se v odstavci nevýhody a výhody použití vždy zvažuje právě uplatnění v rámci této metody. Taq polymerasa byla původně izolována z termofilní eubakterie Thermus aquaticus. Dnes se získává jako rekombinantní enzym z E. coli. Je to vysoce procesivní polymerasa (průměrně zařadí 50 nukleotidů než se odpojí od templátového řetězce), má 5´  3´ exonukleasovou aktivitu, nemá 3´  5´ exonukleasovou aktivitu. Inkorporuje dUTP a dUTP, modifikované např. digoxigeninem, biotinem či fluoresceinem. Má i slabou terminální deoxynukleotidyltransferasovou aktivitu. Výhody a nevýhody použití:Vysoké výtěžky do 2 Kpb, prosadí se v kompetici s dalšími polymerasami, má značnou frekvenci chyb (10-5/bp), která se ještě zvyšuje při vyšší koncentraci dNTP, Mg++ a v přítomnosti Mn++, produkuje A přesahy (vhodné pro TA klonování, nevhodné pro spojování natupo), nemůže pokračovat v polymeraci, když zařadí některé nekomplementární nukleotidy, používá se pro standardní PCR, značení a v kombinaci s dalšími polymerasami pro PCR dlouhých úseků až do 35 Kbp. Pwo polymerasa původně z termofilní bakterie Pyrococcus woesei, nyní rekombinantní enzym z E. coli, nemá 5´  3´ exonukleasovou aktivitu, má 3´  5´ exonukleasovou aktivitu, nemá Tdt aktivitu. Zařazuje i modifikované dUTP, procesivitu má nižší než Taq (20-30 bp), délku produktů do 3 Kbp a nízkou frekvenci chyb (10-6/bp). Výhody a nevýhody použití: Vysoká přesnost, snížená procesivita, vysoká stabilita, netvoří A-přesahy, používá se v kombinaci s ostatními polymerasami pro PCR dlouhých úseků. Tth polymerasa z eubakterie Thermus thermophilus sp. je vysoce procesivní, nemá 3´  5´ exonukleasovou aktivitu, má výraznou reverzní transkriptasovou aktivitu, mnohem větší než Taq a DNA polymerasa I, zařazuje i modifikované dUTP, má slabou 5´  3´ exonukleasovou aktivitu a Tdt aktivitu, produkuje polynukleotidy do 3 Kb na DNA-templátě a do 1 Kbp na RNA-templátě. Výhody a nevýhody použití: Vhodná pro RT PCR, produkuje A-přesahy. „Hot Start“ Taq polymerasaje modifikovaná rekombinantní Taq polymerasa, která je neaktivní do 75°C, je aktivovatelná při 95°C, je vhodná pro techniky horkého startu. Jinak vlastnosti obdobné Taq polymerase.

18. Terminální nukleotidyltransferáza

19. Alkalická fosfatáza • Bacterial alkaline phosphatase (BAP) • Calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP) • Shrimp alkaline phosphatase

20. Polynukleotid kináza • Praktické využití: • fosforylace linkerů a adapterů + PCR • radioaktivní značení oligonukleotidů

21. Ligázy T4 DNA ligáza využívá ATP

22. http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gifhttp://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/images/LigaseAnimation6.gif