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Sophie LEDRU

28 Octobre 2005. Sophie LEDRU. Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement d’un biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct d’électrons. Travail réalisé sous la direction de Mohammed BOUJTITA.

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Presentation Transcript

  1. 28 Octobre 2005 Sophie LEDRU Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement d’un biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct d’électrons Travail réalisé sous la direction de Mohammed BOUJTITA

  2. Préparation de biocapteurs sérigraphiés adaptés à l’analyse par injection en flux continu Caractéristiques des encres conductrices ? Transfert direct possible? Utilisation en AIFC ? Objectifs de cette étude Projet global: Questions préliminaires: Introduction

  3. Analyse par injection en flux continu Introduction

  4. Avantages • Analyse rapide et automatisable • Appareillage simple et peu coûteux Contraintes • Mise au point d’une cellule d’analyse adaptée • Optimisation des méthodes d’immobilisation des composants Analyse par injection en flux continu • Technique dynamique • Détection ampérométrique Introduction

  5. Plan de la présentation • Les électrodes sérigraphiées • Caractérisation électrochimique du transducteur • Modification de l’encre par la HRP • Application à la détection du L-lactate • Les électrodes sérigraphiées • Caractérisation électrochimique du transducteur • Modification de l’encre par la HRP • Application à la détection du L-lactate

  6. encre raclette écran cadre substrat Porte-substrat Film imprimé La sérigraphie: principe général 1. Les électrodes sérigraphiées

  7. DEK 245: Machine semi-automatique Raclette Support écran Pompe Porte-substrat 1. Les électrodes sérigraphiées

  8. Support Contre Électrode Électrode de Référence Électrode Indicatrice Couche Diélectrique Les électrodes sérigraphiées • Électrodes prêtes à l’emploi jetables • Facilité d’utilisation • Production à grande échelle rapide et peu coûteuse 1. Les électrodes sérigraphiées

  9. La cellule de détection Cellule de type « wall-jet » sortie entrée 1. Les électrodes sérigraphiées

  10. L E C Différentes configurations possibles S I II III Albareda-Sirvent M., Merkoçi A., Alegret S. Sensors and Actuators B 69 (2000) 153-163 1. Les électrodes sérigraphiées

  11. Encre biocomposite Particules conductricesGraphite • Impression de l’électrode en une seule étape • Optimisation indispensable de la composition Solvant Cyclohexanone Encre biocomposite Polymère Acétate de cellulose Enzyme Peroxydase de raifort (HRP) 1. Les électrodes sérigraphiées

  12. Plan de la présentation • Les électrodes sérigraphiées • Caractérisation électrochimique du transducteur • Modification de l’encre par la HRP • Application à la détection du L-lactate

  13. Poudre de graphite = + Liant Encre Préparation de l’encre conductrice (27 %) (73 %) Homogénéisation par malaxage mécanique Vérification de la rhéologie (viscosité, stabilité,…) 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

  14. Conditions expérimentales • Encres de différentes compositions: 14, 23 ou 30 % de polymère • Acétate de cellulose (AC) • PVC • Couple Fe(CN)63-/Fe(CN)64- • Solution 1 ou 2 mM dans KCl 1 mol.L-1 • Voltampérométrie cyclique • Spectroscopie d’impédance électrochimique 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

  15. « Méthode de Nicholson » Nicholson R. S. Analytical Chemistry 37 (1955) 1351-1355 Ψ = γα k° (πaDo)-1/2 γ = (Do/Dr)1/2 et a = nFv/RT k° ΔEp v Étude des cinétiques de transfert électronique ΔEp > 60mV Étude par voltampérométrie cyclique 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

  16. AC 14% 23% 30% Nicholson 103*k° 1,4 ± 0,3 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1 Butler-Volmer 103*k° 1,3 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1,4 ± 0,3 α 0,55±0,09 0,38±0,1 0,24±0,06 Étude des cinétiques de transfert électronique « Équation de Butler-Volmer » α A Ipc = -0.027nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’c ) Ipc = -(3,01*105)n3/2α1/2ADo1/2v1/2C k° 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

  17. Limitation du transfert électronique par le polymère Étude des cinétiques de transfert électronique « Équation de Butler-Volmer » α A Ipc = -0.027nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’c ) Ipc = -(3,01*105)n3/2α1/2ADo1/2v1/2C k° A = 2,0 ± 0,4.10-2 cm2 k° = 1,5 ± 0,4.10-3 cm.s-1 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

  18. Rm Qdc Qjg Rjg Étude morphologique de la surface de l’électrode Rugosité de la surface x 200 MEB Électrode sérigraphiée (AC 14%) 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

  19. Rm Qdc Qdc Rtc Qdif Qdif Circuit de Randles Qjg Rtc Rdif Rjg 14% AC Circuit proposé : Surface et solution Masse de l’électrode Modélisation du comportement électrochimique de la surface χ² < 10-4 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

  20. Rm Qdc Qdif Qjg Rtc Rdif Rjg Circuit proposé : Surface et solution Masse de l’électrode Modélisation du comportement électrochimique de la surface 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

  21. Plan de la présentation • Les électrodes sérigraphiées • Caractérisation électrochimique du transducteur • Modification de l’encre par la HRP • Application à la détection du L-lactate

  22. H202 HRP(red) I (nA) H20 HRP(ox) Système étudié • Biocapteur de troisième génération • Transfert direct d’électrons 3. Modification de l’encre par la HRP

  23. « Encre standard » Récepteur(s) biologique(s): Enzyme(s) (HRP, LOD,…) + « Poudre modifiée » Préparation de l’encre modifiée Encre modifiée = Matériau conducteur: Carbone/graphite Liant polymère + 3. Modification de l’encre par la HRP

  24. 200 200 12,5 nA 12,5 nA 12,5 nA 5 min 5 min 5 min 100 100 25 nA 50 50 5 min 60 Utilisation en AIFC Détection de H2O2 (µmol.L-1) à 0 V vs. Ag/AgCl 30 3. Modification de l’encre par la HRP

  25. Fonctionnement de l’électrode enzymatique 3. Modification de l’encre par la HRP

  26. E°’= -0,17 ± 0,05 V vs. Ag/AgCl Étude similaire pour la pâte de carbone: Ledru S., Boujtita M. Bioelectrochem.200464 71-78 Transfert direct HRP / graphite Vitesse de balayage 20 mV/s Tampon Phosphate 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl E°’= -0,16 ± 0,04 V vs. Ag/AgCl Couple de la HRP Hème- Fe(III) / Hème-Fe(II) 3. Modification de l’encre par la HRP

  27. 400 300 ks 200 D - I / nA k1 H2O2 100 0 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 2e- E / V vs. Ag/AgCl H2O Mécanismes électrocatalytiques Voltamogramme hydrodynamique 3. Modification de l’encre par la HRP

  28. 400 300 200 D - I / nA TP 100 H2O2 0 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 E / V vs. Ag/AgCl Vitesse de balayage: 20 mV/s Tampon phosphate désoxygéné 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl Mécanismes électrocatalytiques 3. Modification de l’encre par la HRP

  29. TP TP O2 H2O2 Mécanisme proposé R. Huang et N. Hu Bioelectrochem.,2001,54 75-81 Mécanismes électrocatalytiques 3. Modification de l’encre par la HRP

  30. Optimisation de l’encre biocomposite 3. Modification de l’encre par la HRP

  31. 14% AC 23% PVC 30% sensibilité Limitation de la diffusion linéarité Influence du polymère Acétate de cellulose (AC) ou PVC 14%, 23% ou 30% AC 3. Modification de l’encre par la HRP

  32. Électrodes à pâte de carbone HRP Mélange au solvant Séchage Adsorption sur le graphite Mélange au solvant Séchage Malaxage avec l’huile de paraffine Électrode de référence Électrode “après adsorption” Électrode  “ avant adsorption” Influence du solvant sur l’adsorption 81,8  8,6% 46,5  5,8 % 100 % Influence du solvant organique 3. Modification de l’encre par la HRP

  33. HRP oxydée HRP native Modification chimique de la HRP • Pourquoi ? Couplage avec la LOD (lactate oxydase) • Comment ? Oxydation par le NaIO4 • (Formation de fonctions aldéhydes par oxydation des résidus glucidiques) • Diminution de l’activité enzymatique en solution 3. Modification de l’encre par la HRP

  34. Ordonnée à l’origine 1/Ilim = f (V-3/4) 1/Icin TDE TDE Médiateur Med Pente (Med) HRP en TDE = Pente (TDE) HRP totale Étude quantitative du transfert direct d’électrons Théorie de « Koutecky-Levich » adaptée à l’AIFC A. Lindgren, F.-D. Munteanu, I. G. Gazaryan, T. Ruzgas, L. Gorton, J. Electroanal. Chem.,1998,458 113-120 3. Modification de l’encre par la HRP

  35. HRP native HRP oxydée ΓHRP totale (pmol.cm-2) 19 ± 1 47 ± 1 ΓHRP TDE (pmol.cm-2) 11 ± 1 17 ± 1 % de HRP en TDE 58 ± 5 36 ± 5 Formation de dimères* de la HRP avant l’adsorption *A. M. Azevedo, V. Vojinovic, J. M. S. Cabral, T. D. Gibson, L. P. Fonseca, J. Mol. Cat. B, 2004,28 121-128 Modification chimique de la HRP Hypothèses: k1(nat) = 1,3.105 s-1.mol-1.L ; k1(ox) = 0,8 . k1(nat) =1,04.105 s-1.mol-1.L A = 0,0314 cm2 Constante de vitesse relative au TDE: ks ≈ 3 s-1 S. Ledru, N. Ruillé, M. Boujtita, Biosens. Bioelectron.,2005,sous presse 3. Modification de l’encre par la HRP

  36. Plan de la présentation • Les électrodes sérigraphiées • Caractérisation électrochimique du transducteur • Modification de l’encre par la HRP • Application à la détection du L-lactate

  37. Système étudié Électrode sérigraphiée bienzymatique 4. Application à la détection du L-lactate

  38. Plan d’expériences Critères d’optimisation: • Sensibilité • Zone de linéarité Choix des paramètres à étudier: 4. Application à la détection du L-lactate

  39. positif négatif 2,4 U de LOD / mg ; 14 % d’AC; Oxydation de la HRP Plan d’expériences 4. Application à la détection du L-lactate

  40. Validation Courbe de corrélation (UV = Méthode de référence) Solutions standards y = 1,10x + 0,005 4. Application à la détection du L-lactate

  41. Validation Echantillons réels (UV = Méthode de référence) Produits laitiers (riches en lactate) 4. Application à la détection du L-lactate

  42. Validation Echantillons réels (UV = Méthode de référence) Produits à base de tomates (pauvres en lactate) 4. Application à la détection du L-lactate

  43. Interférences à la détection du lactate Interférent modèle: l’acide ascorbique AL 1:0 Réduction 1:0,5 1:1 Voltamogramme hydrodynamique (Acide ascorbique ) 1:2 AA 0:1 4. Application à la détection du L-lactate

  44. Mécanisme EC’ [HRP-Fe(II)](n-1)+ → [HRP-Fe(III)]n+ + e- [HRP-Fe(III)]n+ + Asc- → [HRP-Fe(II)](n-1)+ + P P. Ugo, V. Zangrando, L. M. Moretto, B. Brunetti, Biosens. Bioelectron., 2002,17 479-487 S. Ledru, M. Boujtita, Bioelectrochem., 2004, 64 71-78 Mécanisme des interférences Oxydation catalytique AA / HRP-ES AA / ES nue TP / HRP-ES 4. Application à la détection du L-lactate

  45. Cinétiques de transfert électronique influencées par le liant polymère Transfert direct d’électrons entre le graphite et la HRP immobilisée Mise en évidence du couple hème-Fe(III) / hème-Fe(II) Augmentation de la quantité de HRP en TDE par oxydation Influence des composants de l’encre sur les propriétés du biocapteur Limitation de la diffusion du substrat par le polymère Désorption de la HRP due à la présence d’un solvant organique Application à la préparation d’une électrode bienzymatique Méthode validée pour les produits laitiers Problème d’interférences avec l’acide ascorbique pour les produits pauvres en L-lactate Conclusions

  46. Perspectives • Poursuivre les études en impédance • Caractériser la rhéologie des encres • Etudier l’effet de l’oxydation sur l’activité de la HRP • Comprendre l’influence du solvant • Augmenter la stabilité de stockage des électrodes modifiées par la HRP • Résoudre le problème des interférences • Adapter le procédé à la détection d’autres analytes

  47. Dr F. Fleury (Université de Nantes) Dr C. Cougnon (Université du Maine) N. Ruillé F. Ghamouss Remerciements

  48. Merci pour votre attention

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