Národní fytosanitární workshop “ Současné fytosanitární úkoly a směrování výzkumu v ČR

1. Národní fytosanitární workshop “ Současné fytosanitární úkoly a směrování výzkumu v ČR z pohledu výzkumných i ostatních institucí v kontextu s rozvojem spolupráce v EU“ dne 3. 3. 2009 Současný výzkum virů a viroidů bramboru Ing. Petr Dědič,CSc. Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.

2. Výzkumné projekty NAZV "Bezvirové brambory – eradikace viru S ve šlechtění a množení" (1997 - 2000) "Bezvirové šlechtění bramboru" (2001 - 2004) se zabývaly především problematikou udržovacího šlechtění a programy aktivního ozdravování. Výsledky byly podkladem pro zařazení PVS do oficiálních kritérií kontroly zdravotního stavu základních stupňů sadby v posklizňových zkouškách u nás. Významný vliv na stupeň reinfekcí PVS měly především přítomnost infikovaných rostlin v i mimo sledovaný porost, stupeň rezistence odrůd a počet roků expozice materiálu v polních podmínkách. Explantátové kultury a zkrácený cyklus udržovacího šlechtění a množení přineslo výrazné pozitivní výsledky. Výhody těchto postupů nebyly plně využity na úseku šlechtění nových odrůd kde do registračních zkoušek byli přihlašováni kříženci se 100% infekce PVS a vlastní ozdravovací proces byl zahajován většinou až po, nebo těsně před povolením odrůdy.

3. Navazující projekt 1B53036 Novošlechtění bramboru na bezvirovém základě • Doba řešení: 2005 – 2008, • byl proto zaměřen výlučně na materiály novošlechtění a zahrnoval prakticky celý rozsah šlechtění nových odrůd bramboru v ČR. • V rámci navrhovaných aktivit řešení projektu byly sledovány rozhodující faktory získání a uchování bezvirových materiálů jako je: • úroveň rezistence kříženců k PVS (ale též k některým dalším devastujícím kmenům virů, např. PVY-N), • komplexní systém laboratorní diagnózy virů ze skleníkových a polních výsadeb, • efektivní převody časných generací kříženců do kultury in vitro a jejich aktivní ozdravování v podmínkách in vitro. • aplikace metod molekulární analýzy, jako podklad pro jednoznačnou identifikaci nových gentypů • Návrat perspektivních kříženců do zkráceného systému množení byl směrován k zajištění bezvirové hlízové produkce pro registrační zkoušky (RZ).

4. Souběžně s řešením problematiky viru S bramboru probíhal výzkum viru Y bramboru v těchto projektech: Grantová agentura České republiky 2000 - 2002 Název projektu: Molekulární variabilita izolátů viru Y bramboru (PVY) Registrační číslo projektu: 522/00/227 Řešitelská pracoviště: Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Ústav molekulární biologie rostlin AV ČR České Budějovice Na tomto úseku probíhala rovněž mezinárodní spolupráce s Francií v rámci projektu BARRANDE a následně byl řešen projekt NAZV QC 1167 Identifikace, diferenciace a charakterizace původců nekróz bramboru virové etiologie Řešitelská pracoviště: VÚB Havlíčkův Brod ÚMBR AV ČR Č. Budějovice ÚEB AV ČR Praha Doba řešení: 2001 – 2004 Cíl řešení: Vypracování spolehlivé laboratorní diagnostické a diferenciační metody pro viry bramboru přenosné v půdě a nekrogenní izoláty viru Y bramboru (PVY-NTN), včetně ověření citlivosti a vnímavosti odrůd bramboru k infekci a její vliv na kvalitativní parametry.

5. PMTV TRV PVY-NTN cv. Hermes Nadine Nicola Kobra

6. Největší pozornost byla věnována kmenové diferenciaci PVY, které se staly nejzávažnějším virózou bramboru.

7. Příznaky infekce PVY na rostlinách tabáku N. tabacum cv. Samsun PVY-N PVY-O

8. PVYN605 5’ 3’ NTR NTR P1 HC-Pro P3 CI NIa NIb CP 5’ 3’ NTR NTR PVYNTN-H CI P1 HC-Pro P3 CI NIa NIb CP P3 5’ 3’ NTR NTR PVYO-139 P1 HC-Pro P3 CI NIa NIb CP • Organizace génomu PVY-NTN PVYN or PVYN- related profiles PVYOor PVYO - related profiles

9. Organizace génomu PVY-Wilga PVYN605 5’ 3’ NTR NTR P1 HC-Pro P3 CI NIa NIb CP 5’ 5’ 3’ 3’ NTR NTR NTR NTR PVYNWi-P P1 HC-Pro P3 CI NIa NIb CP PVYNW N242 HC-Pro P3 CI NIa NIb P1 CP 5’ 3’ NTR NTR PVYO-139 P1 HC-Pro P3 CI NIa NIb CP PVYN or PVYN- related profilesPVYO or PVYO- related profiles

10. QF 3109 Diferenciace viru S bramboru (PVS) a identifikace karanténně významných izolátů technikami molekulární diagnózy Plánovaná doba řešení: 2003 – 2007 Řešitelé: VÚB Havlíčkův Brod ÚMBR AV ČR České Budějovice Cíl řešení: Detailně charakterizovat kmenové spektrum viru S bramboru pomocí biologických, sérologických a nově vyvinutých, ověřených molekulárních metod a postupů. Předat optimalizované diferenciační postupy státní správě k realizaci na úseku fytokarantény. Příklady aktivit A01/06 Detekce viru S bramboru (PVS) v materiálech génové banky, tuzemských šlechtitelských materiálech a  importované sadbě A02/06 Sekvenování fragmentů molekulárního bypassu izolátů PVS-CS a jejich porovnání s genomy PVS-O A03/06 Rozpracování metody molekulární hybridizace pro detekci viru S bramboru A04/06 Diferenciace izolátů PVS na indikátorových rostlinách a molekulárními technikami zaměřenými na vybrané oblasti génomu A05/06 Charakterizace biologických vlastností vybraných izolátů PVS ze skupiny O a CS A06/06 Biolostická infekce směsnými vzorky PVS-CS a PVS-O a vytipování možných rekombinantních klonů.

11. Výsledky uznávacího řízení sadby v ČR 2000 - 2008 Celkem Zkoušeno Uznáno Sestupněno Neuznáno ČR ha % % % 2000 5673 92,4 1,0 6,6 2001 5178 95,1 0,7 4,2 2002 5158 78,0 3,2 18,8 2003 4689 87,8 2,3 9,9 2004 4933 89,4 3,6 7,0 2005 4424 88,3 3,2 8,5 2006 3613 73,8 3,0 23,1 • 3831 71,0 5,9 23,2 2008 3931 74,9 5,0 20,3 Dle údajů ÚKZÚZ

12. Výskyt virů bramboru ve vzorcích sadby v posklizňových zkouškách (ks pozitivních reakcí ELISA) Rok V i r u s PLRV PVY PVA PVX/PVM (PVS) -------------------------------------------------------------------------------------- 2006 1.148 16.055 25 296 4.466 2007 3.232 15.257 64 254 5.518 -------------------------------------------------------------------------------------- 2006 L/Y 7,2% 2007 L/Y 21,2% Podkladové materiály ÚKZÚZ

13. QH 71123:Variabilita viru svinutky bramboru (PLRV), zvýšení spolehlivosti jeho detekce a uplatnění transgenóze v rezistentním šlechtění Plánovaná doba řešení: 1.5. 2007 – 30.12.2011 Cíl řešení: Ověření biologické a molekulární variability izolátů PLRV, zvýšení spolehlivosti jeho laboratorní detekce, identifikace a diferenciace. Studium možností uplatnění transgenóze v rezistentním šlechtění bramboru. Aktivity : - Doplnění kolekce izolátů PLRV a jejich charakterizace  - Biologické vlastnosti izolátů PLRV- Varianty imunologické diagnózy, spolehlivost detekce - Varianty molekulární diagnózy (RT-PCR) a spolehlivost detekce PLRV - Sekvence vybraných úseků genomu PLRV, návrh hybridizačních sond- Příprava binárního vektoru pro transformaci rostlin a transformace vybraných genotypů bramboru.

14. Detekce izolátů PLRV pomocí RT-PCR (primery dle Solman et al., 2002) • ref 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Z1 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 • ref hmotnostní standard • Z1 negativní kontrola • Izoláty PLRV (1/001 – 1/1/045)

15. Pokrytí genomu PLRV sekvenováním 23 29 21 32 1 2 6 3 7 9 10 25 11 14 27 16 28 17 8 4 2 5 0 1 6 7 3 53 5000 1000 2000 3000 4000 5900 5R 4R 22R 8R 20R 12R 26R 13R 18R 19R 24R 15R

16. Návrh binárního vektoru pro transformace bramboru

17. od roku 2008 se dále podílíme na řešení projektu NAZV QH81262 Riziko zdrojů karanténního viroidu PSTVd pro produkční kultury Solanaceae (brambory a rajčata) v souvislosti s jeho zjištěním v okrasných rostlinách Řešitelské pracoviště:Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v.v.i. Průhonice a Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Plánovaná doba řešení: 2008 – 2011 Cíl řešení: Zjistit a vyhodnotit nově vzniklá rizika karanténního viroidu PSTVd pro produkční kultury Solanaceae (brambory a rajčata) v souvislosti s jeho zjištěním v okrasných rostlinách v ČR.

18. V rámci projektu Výzkumné centrum 1M06030 (MŠMT) „Funkční genomika a proteomika ve šlechtění rostlin“ Doba řešení 2006-2009 řešíme spolu s ÚEB AV ČR v.v.i. Praha výstup V006: Diagnostika virových onemocnění: - připravit polyklonální protilátky vůči vybraným rekombinantním antigenům kódovaným genomy virových patogenů brambor a testovat jejich využití v diagnostice odpovídajících virových oněmocnění DC6681: Výběr vhodných postupů a syntéza protilátek proti rekombinantním antigenům rostlinných virů. DC6791: Ověření účinnosti protilátek proti rekombinantním antigenům virů bramboru. Participujeme dále na výzkumném projektu Akademie věd ČR 1QS500510558 : Studium výskytu fytopatogenů a jejich genetických variant Doba řešení 2005-2009 Řešitelské pracoviště: Biologické centrum AV ČR, v.v.i. České Budějovice

19. Výzkumný záměr VÚB MSM 6010980701Molekulární a technologické základy produkce kvalitních brambor • MŠMT (2004-2010) • Etapa 01: Vývoj, ověření a uplatnění molekulárních metod detekce a kvantifikace vybraných patogenů a genetických struktur u brambor (q RT-PCR, detekce virů a viroidů (PSTVd), detekce GMO,diagnostické čipy)

20. NÁVRH PROJEKTU DO VEŘEJNÉ SOUTĚŽE VE VÝZKUMU A VÝVOJI Programu výzkumu v agrárním sektoru 2007-2012 s počátkem řešení projektů v roce 2009 na roky 2009 - 2011poskytovatel - MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍ Evideční číslo projektu - přidělí NAZV Podací číslo projektu Vir2 Název projektuStudium výskytu kmenových skupin a variant viru Y bramboru (PVY) v sadbě bramboru v ČR VEŘEJNÁ SOUTĚŽProgramu výzkumu v agrárním sektoru 2007-2012 s počátkem řešení projektů v roce 2009 na roky 2009 - 2011 PODPROGRAMEFEKTIVNÍ POSTUPY V AGRÁRNÍM SEKTORUVýzkumný směrOchrana zdraví rostlin a zvířat Cíl projektu Stanovit frekvenci výskytu kmenů a variant PVY ve šlechtitelských a množitelských materiálech sadby brambor v ČR. Charakterizovat zkoušené odrůdy z hlediska vnímavosti a citlivosti k závažným izolátům nekrotického charakteru. Doba řešení1.1.2009 - 31.12.2011 1.Oponent - 'ANO' 2. Oponent - 'ANO' 2. PROGRAMOVÁ KOMISE 'NE' 3. Mze: NE - projekt nebude financován Smlouva nebude uzavřena. Výsledek přijímacího řízení: NEPŘIJATO

21. Identifikace zdrojů virové infekce a jejich eliminace ve šlechtitelských materiálech a sadbě bramboru v ČR VS8MZEVAK0913 - Programu Výzkum v agrárním komplexu, VAK s počátkem řešení projektů v roce 2009 PODPROGRAM UDRŽITELNÝ ROZVOJ AGRÁRNÍHO SEKTORU Zlepšit biologický potenciál kulturních organismů a způsoby jeho využívání pro efektivní produkci potravin. CÍL PROJEKTU Detekce zdrojů virové infekce ve šlechtitelských a sadbových materiálech, charakterizace kmenového spektra PVY a reakce odrůd na infekci novými izoláty, ověření účinných způsobů ozdravení a zvýšení efektivity rezistentního šlechtění pomocí DNA markerů.  Datum zahájení řešení1.6.2009  Výsledky projektu Exaktní identifikace zdrojů virové infekce v porostech výchozích šlechtitelských materiálů, základní a certifikované sadbě,charakterizace izolátů viru Y bramboru na úrovni kmene resp. varianty, ozdravení infikovaných materiálů pro potřeby bezvirového šlechtění a aplikace MAS pro efektivní výběr nšl. s vyšší úrovní rezistence proti nejzávažnějším patogenům, zejména PVY. 

22. Výsledek • Projekt nesplnil podmínku podle článku 9 Rámce Společenství pro státní podporu výzkumu, vývoje a inovací (zvláštní pravidla pro zemědělství a rybolov) – projekt využívá výjimku pro zemědělství (uchazeč VÚB jako střední podnik využívá vyjímku s 90% dotace, přitom střední podnik může mít maximálně 75% dotace vč. bonusu), avšak žádný uchazeč nedodal čestné prohlášení o splnění 4 podmínek k výjimce pro zemědělství podle Rámce). Dále upozorňujeme, že v návrhu projektu chybí výstup na rok 2011.

23. VIROBANKA – shromažďování a udržování izolátů virů in vitro • Využití: • -Bezprostřední • zahájení řešení • výzkumných • projektů. • Př. : • „Kryoterapie…“ • kontrolní izoláty • mezinárodní • výměna Národní program konzervace a využívání genofondu mikroorganismů a drobných organismů hospodářského významu. (Dotační titul) Kolekce izolátů: PLRV-55, PVY-119, PVA-22, PVM-36, PVX-27, PVS-280 Dále: PSTVd, PMTV, TRV, PVV, PAMV, PRDV. Evidence na internetu.