Biologie Moléculaire des Hépatites Virales

Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

QCM 1 GENOME HEPATITE B • ADN linéaire bicaténaire contenu dans une nucléocapside • ARN linéaire monocaténaire de polarité positive • ADN circulaire partiellement double brin • il existe plusieurs cadres de lecture ouverte • il existe un seul cadre de lecture ouverte • code pour 6 protéines

QCM 2 STRUCTURE DE L’ARN • Structure en double hélice • Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de phosphate est le desoxyribose • Les bases azotées contenues dans l’ARN sont identiques à celles de l’ADN • Dans l’ARN, les bases azotées s’apparient 2 à 2, adénine avec thymine et cytosine avec guanine • L’uracile est une base contenue dans l’ARN

QCM 3 PCR ET RT-PCR • Technique qui permet de doubler la quantité d’ADN à chaque cycle • La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR • La préparation de l’ADN est plus délicate que celle de l’ARN • Pour l’ARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la réalisation de la technique • Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on décontamine le matériel à la javel

QCM 4 Tm ET SONDE • La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN donnée • La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu dans l’ADN • La Tm est la température à laquelle l’ADN est complètement dénaturé • Une sonde d’hybridation permet de détecter n’importe quel ADN • Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et de celle des amorces

QCM 5 SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE • Chaque nucléotide correspond à un acide aminée • Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide aminée différent • Un codon est constitué de trois nucléotides • Le code génétique est dit dégénéré • La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour entraîner la modification d’un acide aminée • Le séquençage d’un ADN nécessite de faire une PCR

GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE C • ARN linéaire simple brin de polarité positive de 9.6 kb • 3 régions distinctes: région 5’ non codante, un cadre de lecture ouverte unique, et la région 3’ non codante

GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE B • ADN circulaire, double brin sur 2/3 de sa longueur • Code pour 4 gènes: • gène S (AgHBs) • gène C (AgHBc, AgHBe) • gène P (ADN polymérase) • gène X (protéine HBX)

STRUCTURE ARN/ADN

REPLICATION DE L’ADN REPRESENTATION SCHEMATIQUE Reproduction du génome (ADNpolymérase…) Possibilité d’erreur dans la reproduction: apparition de mutations

95°C 50°C-60°C 72°C ADN Dénaturation Hybridation des amorces Elongation Hybridation des amorces et élongation Reverse Transcription Hybridation de l’amorce Elongation Dénaturation ADNc APPLICATION AU LABORATOIRE: LAPCR – LA RT-PCR PCR: Virus à ADN (HBV) UN CYCLE DE PCR Réactifs:Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques RT-PCR: Virus à ARN (HCV) ARN Réactifs:Reverse transcriptase, Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques

PRECAUTIONS A PRENDRE POUR LA MANIPULATION DE L’ARN • INSTABILITE DE L’ARN / L’ADN • ⇒ plus facilement dégradable • Préparation de l’ARN : étape délicate (Rnases, présence éventuelle d’ADN) • Attention aux contaminations: •différenciation des pièces de travail (pièce « tampon », pièce « pré-ampli », pièce « post-ampli » • •décontamination du plan de travail et de tout le matériel utilisé pour manipuler à la javel

DETECTION DES PRODUITS PCR: HYBRIDATION DE SONDE - PRINCIPE La température de fusion Tm est la température à laquelle 50% de l’ADN est dénaturé (simple brin)

CALCUL DE LA TEMPERATURE DE FUSION (Tm) Oligonucléotide inférieur à 20 nt Tm (en °C) = (A+T)x2 + (G+C)x4 Oligonucléotide supérieur à 20 nt Tm (en °C) = [(A+T)x2 + (G+C)x4] x (1 + [(N-20)/20]) La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN donnée Pour la réalisation d’une PCR, le choix des amorces et de la (ou les) sonde(s) se fait Tm dépendant

SONDEHYBRIDEE A chaque cycle, la fluorescence augmente proportionnellement à la quantité d’ADN produit.

EXPRESSION DU GENOME: SYNTHESE DES PROTEINES TRADUCTION • Chaque triplet de bases ADN code pour un triplet de bases ARN (codon). • Un codon code pour un acide aminé.

Le code génétique Le code génétique est ditdégénéré: Un codon START (AUG) donne le signal du début de séquence. Trois codons STOP(UAA, UAG, UGA) stoppe la synthèse protéique

CCAGGAAGATGG CCAGGAAGATG CCAGGAAGAT CCAGGAAGA CCAGGAAG CCAGGAA CCAGGA CCAGG CCAG CCA CC C + APPLICATION AU LABORATOIRESéquençage - Principe Réalisation d’une PCR avec un mélange de dNTPs et de ddNTPs (blocage de la synthèse d’ADN). Chaque ddNTP est marqué avec un fluorochrome spécifique. Après la PCR, migration sur gel pour séparer les brins en fonction de leur taille et lecture de la séquence en fonction des couleurs de la fluorescence émise

APPLICATION AU LABORATOIRESéquençage – exemple de l’hépatite B Les mutants précore : Absence d’AgHBe TRP GLY Souche sauvage : 1892-T-T-T-G-G-G-G-C-1901 STOP GLY Mutant M1 : 1892- T-T-T-A-G-G-G-C-1901 STOPASP Mutant M2 : 1892- T-T-T-A-G-G-A-C-1901

APPLICATION AU LABORATOIRESéquençage – exemple de l’hépatite B La mutation YMDD sur la polymérase (position 204):résistance au traitement à la lamivudine Y M D D Souche sauvage : -T-T-A-T-A-T-G-G-A-T-G-A-T-G- Y I D D Mutant YIDD: -T-T-A-T-A-T-A-G-A-T-G-A-T-G- Y V D D Mutant YVDD: -T-T-A-T-G-T-G-G-A-T-G-A-T-G-

QCM 1 GENOME HEPATITE B • ADN linéaire bicaténaire contenu dans une nucléocapside • ARN linéaire monocaténaire de polarité positive • ADN circulaire partiellement double brin • il existe plusieurs cadres de lecture ouverte • il existe un seul cadre de lecture ouverte • code pour 6 protéines √ √

QCM 2 STRUCTURE DE L’ARN • Structure en double hélice • Dans l’ARN, les bases azotées s’apparient 2 à 2, adénine avec thymine et cytosine avec guanine • Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de phosphate est le desoxyribose • Les bases azotées contenues dans l’ARN sont identiques à celles de l’ADN • L’uracile est une base contenue dans l’ARN √

QCM 3 PCR ET RT-PCR • Technique qui permet de doubler la quantité d’ADN à chaque cycle • La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR • La préparation de l’ADN est plus délicate que celle de l’ARN • Pour l’ARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la réalisation de la technique • Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on décontamine le matériel à la javel √ √

QCM 4 Tm ET SONDE • La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN donnée • La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu dans l’ADN • La Tm est la température à laquelle l’ADN est complètement dénaturé • Une sonde d’hybridation permet de détecter n’importe quel ADN • Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et de celle des amorces √ √

QCM 5 SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE • Chaque nucléotide correspond à un acide aminée • Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide aminée différent • Un codon est constitué de trois nucléotides • Le code génétique est dit dégénéré • La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour entraîner la modification d’un acide aminée • Le séquençage d’un ADN nécessite de faire une PCR √ √ √

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