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ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDOS

ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDOS. BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL EQUIPO: 4 FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM . OBJETIVOS. Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos.

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ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDOS

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  1. ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL EQUIPO: 4 FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM

  2. OBJETIVOS • Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa. • Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos. • Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos separados en geles de agarosa • Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la biotecnología.

  3. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN cortan sobre la secuencia que reconocen y NO tienen actividad de metilasas de DNA

  4. Enzimas de Restricción • Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

  5. Las enzimas de restricción reconocen secuencias palindrómicas • Palíndrome. segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre científico de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

  6. ROMOS

  7. Formación del DNA recombinante

  8. Electroforesis en gel: separación de las moléculas de DNA Una vez cortado el DNA se separa por electroforesis Los de menor tamaño corren más rápido. Gel de agarosa: especial para DNA Los fragmentos de DNA corren al positivo por los grupos fosfato Se tiñe con bromuro de etidio Se pueden purificar fragmentos de DNA del gel y utilizar.

  9. Aplicaciones • Reconocimiento de una determinada secuencia de DNA para detectar un polimorfismo • Medicina legal; Técnica de hibridación de Southern donde la enzima mas usada es HaeIII • Identificación de patógenos causante de enfermedades Adenovirus

  10. La clonación en una bacteria de un fragmento de DNA • Eliminación de secuencias genómicas • Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. • Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

  11. ¿Qué vamos ha hacer en la práctica? 1. Usar células que fueron transformadas en la clase experimental

  12. Células que contendrán: Vector de clonación o Vector vacío • Sitio múltiple de clonación

  13. Células transformantes con el Vector recombinante • El gen de interés se inserto entre las secuencias que cortan las enzimas BamHI y NedI. • Ambas enzimas producen extremos cohesivos y en el vector recombinante solo cortan 1 vez cada una

  14. Desarrollo experimental Ensayo de restricción Centrifugar 5 seg. Eliminar RNA (opcional) Incubar 100°C/5min

  15. ¿Qué esperamos? * Revisaremos los topoisomeros en la sección de corrimiento electroforético

  16. Bibliografía • Madigan Martinko, et al, Brock biología de los microorganismos, Pearson education, 2008, pp: 300-350. • Tortora J. Gierard. Introducción a la microbiología, Ed Medica Panamericana, 2007 pp 256-257. • http://uvigen.fcien.edu.uy/utem/herramgen/recomb.pdf. 12/10/11 8:40 am • http://academic.uprm.edu/~jvelezg/Lab12.pdf. 12/10/11 8:41 am

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