Diamino-pimelinsav meghatározása

1. Diamino-pimelinsav meghatározása Készítette: Kelényi Janka

2. Diamino-pimelinsav (DAP) • Diaminosavak csoportjába tartozik. • Lizin ε-karboxi-származéka. • Nem-fehérjeépítő aminosav. • Baktériumok sejtfalának jellemzője. Jelenlétében normál növekedés, hiányában nem képesek új sejtfal-proteoglikánokat előállítani. • Minden Gram-negatív baktériumban, azonban csak néhány Gram-pozitív baktériumban jelenik meg. Kelényi Janka

3. DAP • A Braun-féle lipoproteinek diaminopimelinsavon keresztül kapcsolódnak a Gram-negatív sejtfalakhoz. • A Gram-negatív Escherichia coli esetében diaminopimelinsavhoz közvetlenül kapcsolódik a szomszéd láncvégi D‑alanin. A sejtfal teichoinsav nélkül tömörebb, így kisebb rétegvastagság mellett is szilárd. Kelényi Janka

4. DAP meghatározás Grant és West egyszerűsített módszere • Hidrolízis tömény sósavval • Tisztítás • Papír kormatográfiás vizsgálat • Elemzés • 80%-os visszanyerés Kelényi Janka

5. DAP meghatározás Mikrohullámmal gyorsított eljárás • Egészsejtes hidrolízis folyadék és gőzfázisban lévő 6 N sósavval, lezárt edényben. • Nyomás és hőmérséklet érzékelővel ellátott mikro használata. • Folyadék- és gőzfázisú mikrohullámmal történő eljárással azonos minőségű eredmény nyerhető, mint a hagyományos módszerrel. • A hidrolízis időtartama így 16-20 óráról kevesebb, mint 10 percre csökkenthető • A teljes vizsgálati idő kevesebb mint 90 perc • A gőzfáziú megoldás esetében megkönnyíti az eljárás menetét a fázisok közötti sósavmosás elhagyása Kelényi Janka

6. Grant és West módszere I. Módszer elve: • DAP extrakció talajból • Hidrolízis HCl-al • Mennyiségi meghatározás • Vékonyréteg kromatográfia Anyagok és eszközök: • Spektrométer • Rotációs bepárló • Kromatográfiás papír • Rázógép • Vízfürdő (25-100°C között állítható) • Szűrőpapír • Centrifuga és centrifuga csövek Kelényi Janka

7. Grant és West módszere II. Vegyszerek: • HCl (12 M) • trimetilkloroszilán (1% toluol) • pellet NaOH • Mozgó fázis I (30:20:6:24 V/V) • Bután-1-ol • Piridin • Ecetsav, tömény • Víz • Mozgó fázis II (7:1 V/V) • Buán-1-ol • Hangyasav Kelényi Janka

8. Grant és West módszere III. Vegyszerek: (folytatás) • Ninhidrin reagens • 1g ninhidrin • 100 mg kadmium-acetát • 5 ml ecetsav • 100 ml aceton • 10 ml desztillált víz • H2SO4 (tömény) • Metanol • DAP standard oldat Kelényi Janka

9. Grant és West módszere IV. Eljárás: • 3 db 2,5g talajminta bemérése • Inkubálásrázógépen (100 fordulat/perc) • 25°C • 48 óra • 20 ml HCl (12 M) • Hidrolizálás • 20 ml desztillált víz • 105°C • 18 óra • Hidrolizátumok szűrése • Maradékok kimosása 2x10 ml desztillált vízzel • Lombik szililezése a felszíni DAP abszorpció megelőzésére • Rotációs bepárlóval 45-50°C-on a szűrőket kiszárítjuk (3x) Kelényi Janka

10. Grant és West módszere V. Eljárás: (folytatás) • Semlegesített hidrolizátumot desztillált vízbe visszaoldjuk • Huminanyagok eltávolítása centrifugálással • A felülúszókat adott térfogatra egészítjük ki • DAP meghatározás • Whatman papír • 2 cm-es távolságban viszik fel az egyes mintákat • 72 óra • Levegőn szárítása a kromatográfiás papíroknak • Ninhidrin reagensbe mártás Kelényi Janka

11. Grant és West módszere VI. Eljárás: (folytatás) • Folt előhívása, kivágása • 24 órán belül • Tömény H2SO4-val • Sötétben • A foltok eluálása 4 ml metil-alkohollal • 500 nm-en spektrofotometriás mérés • Minden kromatográfiás papírból kivágunk egy ugyanakkora darabot (vak minta), mint a mintáknál és mossuk 4 ml metil-alkohollal. Ezzel a háttér-abszorbancia értékkel korrigálunk a mérés során. Kelényi Janka

12. Grant és West módszere VII. Eredmények: • Érzékenysége kb. 10 μg/ g talaj • Extrakciós veszteség max. 38 % • Talaj élettelen szerves frakciójában megjelenik a DAP Kelényi Janka

13. Felhasznált irodalom • http://hu.wikipedia.org/wiki/Diamino-pimelinsav • delfin.unideb.hu/~szentirm/mikrobana.doc • http://davidcwhite.org/fulltext/310.pdf • Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 Kelényi Janka

14. Köszönöm a figyelmet! Kelényi Janka