1 / 43

Molekulārās metodes mikrobioloģijā

Molekulārās metodes mikrobioloģijā. Teorija 3 . E. coli šūnu transformācija. 20 12 ./20 13 . mācību gada 2 . semestris. Māris Lazdiņš. Transformācija. Transformācija (lat. transformatio – pārveidošana).

sage
Télécharger la présentation

Molekulārās metodes mikrobioloģijā

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Molekulārās metodes mikrobioloģijā Teorija 3. E. colišūnu transformācija 2012./2013. mācību gada 2. semestris Māris Lazdiņš LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  2. Transformācija Transformācija (lat.transformatio– pārveidošana) Baktēriju transformācija - jaunu ģenētisko (fenotipisko) marķieru iegūšanu, uzņemot svešu DNS no apkārtējās vides. Baktērija, uzņemot svešu ģenētisko materiālu transformējas vai pārveidojas - izmainās tās genotips un varbūt arī fenotips. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  3. Transformācija Pirmais baktēriju transformācijas efektu 1928. gadā aprakstīja Freds Griffits. Viens no plaušu karsoņa (pneimonijas) izraisītājiem - Streptococcus pneumoniae, izolēts no slimniekiem veido gludas (S) kolonijas, starp tām gadās atrast arī mazākas, matētas kolonijas (R), kurās esošie mikroorganismi eksperimenta dzīvniekos slimību nespēj radīt. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  4. Transformācija R S S LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  5. Transformācija S S + R S LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  6. Transformācija Grifita eksperiments: liecināja, ka nonāvētās tipa S baktērijas ir spējušas transformēt dzīvās R tipa baktērijas par S tipa baktērijām. Šis atklājums bija par pamatu tālākiem eksperimentiem, lai 1944. gadā pierādītu ģenētiskās informācijas nesēja ķīmisko dabu - tās ir DNS molekulas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  7. GI priekšvēsture 1944. gadā O.T. Avery, C.M. MacLeodunM. McCarty pierāda, ka DNS ir šūnas ģenētiskais materiāls. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  8. Transformācija Dabīgā DNS fragmentu transformācija: Uzņemtie DNS fragmenti piedalās rekombinācijā ar genomisko DNS, kā rezultātā var notikt gēnu konversija, jaunu pazīmju parādīšanās. Transformācijas ceļā parasti tiek uzņemts arī plazmīdu DNS. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  9. Transformācija Spēju uzņemt svešu DNS var inducēt arī baktērijās, kurām dabiskas transformēšanās spējas ir ļoti vājas - tās var padarīt kompetentas veicot to ķīmisku vai fizikālu apstrādi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  10. Transformācija "Ķīmiskās" metodes 1970. gadā Mandel un Higa atklāj, ka E. coli infekcija ar l DNS efektīvāk notiek Ca2+ klātbūtnē. Mandel M, Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J Mol Biol. 1970 Oct 14;53(1):159-62. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  11. Transformācija "Ķīmiskās" metodes 1972. gadā Stanley Cohenar līdzstrādniekiem publicē rezultātus par iespēju E. coli transformēt ar R-faktoriem (antibiotiku rezistences gēnus saturošām plazmīdām) baktēriju šūnas apstrādājot ar CaCl2. Stanley N. Cohen, Annie C. Y. Chang, and Leslie Hsu, Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1972 August; 69(8): 2110–2114. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  12. Transformācija Klasiskajā variantā: - E. coli kultūra tiek audzēta līdz Log fāzes ~ vidusdaļai, kad baktērijas strauji vairojas un kultūrā dominē jaunas šūnas. (OD590=0.85), - kultūru (50 ml) atdzesē ledus vannā un šūnas savāc centrifugējot 0 Co, - šūnas mazgā 0,5 tilpumos (25 ml) atdzesēta (0 Co) 10 mM NaCl un savāc centrifugējot. S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  13. Transformācija Klasiskajā variantā: - šūnas resuspendē 0,5 tilpumos (25 ml) auksta (0 Co) 0,03 M CaCl2 un tur ledus vannā 20 min., - šūnas savāc centrifugējot 0 Co, - šūnas resuspendē 0,1 tilpumā (5 ml) auksta (0 Co) 0,03 M CaCl2, - 200 ml sagatavoto šūnu ar aukstu pipeti pievieno 100 ml DNS šķīduma. S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  14. Transformācija Klasiskajā variantā: - DNS šķīdums tiek sagatavots buferšķīdumā: - 20 mM Tris-Cl (pH 8.0) - 20 mM NaCl - 1 mM EDTA - 30 mM CaCl2 - maisījumu tur ledus vannā 60 min. 60 min. inkubācija 0 Co transformācijas biežumu palielināja 4x. S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  15. Transformācija Klasiskajā variantā: DNS iekļūšanai šūnās būtisks karstuma šoks - 2 min. 42 Co, - strauji atdzesē Co, - pievieno šķidro barotni (1:9), - inkubē 37 Co, - sēj uz agarizētas barotnes platēm ar atbilstošo antibiotisko vielu. S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  16. Transformācija Klasiskajā variantā: DNS iekļūšanai šūnās būtisks karstuma šoks - 2 min. 42 Co, - strauji atdzesē Co, - pievieno antibiotiskas vielas nesaturošu šķidro barotni (1:9), - inkubē 37 Co (~ 60 min.) - sēj uz agarizētas barotnes platēm ar atbilstošo antibiotisko vielu. S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  17. Transformācija - ... - pievieno šķidro barotni (1:9), - inkubē 37 Co (~ 60 min.) - sēj uz agarizētas barotnes ... iznākums palielinās vairāk kā 1 000 x S. Cohen et al (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  18. Transformācija Vislabāk DNS iekļūst šūnās karstuma šoka laikā - maisījumu (DNS+šūnas) tur ledus vannā 60 min. - 2 min. 42 Co, - strauji atdzesē Co, Efektivitāte (transf. š./mg DNS) + DN-āze =>~ 0 bez DN-āzes=>~ 9x104 S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  19. Transformācija Vislabāk DNS iekļūst šūnās karstuma šoka laikā - maisījumu (DNS+šūnas) tur ledus vannā 60 min. - 2 min. 42 Co, - strauji atdzesē Co, Efektivitāte (transf. š./mg DNS) + DN-āze =>~ 8x104 bez DN-āzes=>~ 9x104 S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  20. Modelis divvērtīgo katjonu nozīmei transformācijas Micklos D. and Freyer, G.; DNA Science: A First Course in Recombinant DNA Technology; Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1990, pp. 26–29. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  21. Transformācija Efektivitāte (transf. š./mg DNS) Labāk šūnās iekļūst - superspiralizēta pDNS, - (nelielu izmēru DNS), bet veiksmīgi transformējama arī OC pDNS forma un pDNS di- (multi-) mēri. ~ 9x104 ~ 5,5x104 ~ 3x104 S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  22. Transformācija Lielāks transformācijas biežums, - ja DNS koncentrācija lielāka Taču ne vienmēr tas tā sanāk. S. Cohen et al. (1972) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  23. Transformācija Transformāciju veicinoši apstākļi: • liela DNS koncentrācija nelielā tilpumā (~1 pM); • liela šūnu koncentrācija nelielā tilpumā (~5 x 108 šūnu/100 ml); • šūnām jābūt jaunām(no eksponenciālās augšanas fāzes); • hipotonisks buferšķīdums; • bivalento katjonu klātbūtne. !!! LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  24. Transformācija Bivalento katjonu klātbūtne. Pārbaudīti dažādi joni: Ca2+, Mn2+, Sr2+, Ba2+, Mg2+,Na+, Rb+ Parasti labākie rezultāti iegūti 100 - 200 mM Ca2+, klātbūtnē LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  25. Transformācija Transformāciju veicinoši apstākļi: • zema temperatūra (0 Co) !!!; • strauja, īslaicīga temperatūras paaugstināšana līdz 37o - 42o C (termošoks) !!!; • neitrālu polimēru klātbūtne transformācijas maisījumā (PEG 6000). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  26. Transformācija Termošoks 42o C M. Singh, A.Yadav, X. Ma, E. Amoah; Plasmid DNA Transformation in Escherichia Coli: Effect of Heat Shock Temperature, Duration, and Cold Incubation of CaCl2 Treated Cells. International Journal of Biotechnology and Biochemistry Vol. 6 Nr. 4 (2010) pp. 561–568 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  27. Transformācija Termošoka temperatūraoC Singh et al. 2010 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  28. Transformācija Pēcšoka temperatūra RT - istabas temperatūra Singh et al. 2010 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  29. Transformācijas efektivitāte Transformācijas efektivitāte - transformēto šūnu skaits (izaugušo koloniju skaits) uz vienu mg pievienotās DNS (vidēji ~105-107; ļoti labi - ~109); Transformējot GI konstrukcijas pēc ligēšanas parasti efektivitāte ir ~ 10x mazāka, nekā izmantojot izdalītu pDNS LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  30. Transformācijas efektivitāte Transformācijas efektivitāte Izcilu transformācijas efektivitāti vēlams sasniegt veidojot genomiskās vai kDNS bibliotēkas, lai nezaudētu reti pārstāvētas sekvences. Parastajos DNS klonēšanas eksperimentos tas nav tik izšķiroši. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  31. Transformācijas biežums Transformācijas biežums - transformēto šūnu daļa no kopējā šūnu skaita kompetento šūnu preparātā normāli ~10-5, ļoti labi ~ 10-2 transformanti uz šūnu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  32. Transformācija Transformācijas efektivitāti ietekmē baktēriju celmu genotipi: • Transformējot nemetilētu DNS celmos, kas satur dažādas restrikcijas - modifikācijas sitēmas (hsdR, hsdS, mcrA, mcrBC), efektivitāte būs ļoti maza; • Celmus, kuros ir aktīva homologās rekombinācijas sistēma, sliktāk transformēs DNS, kas satur homologus DNS rajonus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  33. Transformācija Bez "ķīmiskās" apstrādes metodēm aprakstīta virkne citu risinājumu DNS ievadīšanai šūnā: Elektroporācija, kurā izmanto liela sprieguma elektrisko lauku (1-25 kV/cm). Ar īslaicīgu augstsprieguma impulsu palīdzību šūnas membrānā iespējams izveidot mākslīgas poras. Šo metožu grupa sāka attīstīties ap 1982. gadu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  34. Transformācija Elektroporācija. Sākumā metode tika pielietota dzīvnieku šūnu kultūru apstrādei, bet vēlāk tika pielāgota arī mikroorganismu apstrādei. Baktērijām ar šo metodi iespējams panākt ~ 10x lielāku transformācijas efektivitāti nekā pielietojot ķīmiskās apstrādes metodes. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  35. Transformācija Elektroporācija. Nepieciešama speciāla iekārta un materiāli. Elektroporācijas kivete ar iebūvētiem elektrodiem (Eppendorf). Elektroporācijas iekārta (Bio-Rad). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  36. Transformācija Bez "ķīmiskās" apstrādes metodēm aprakstīta virkne citu risinājumu DNS ievadīšanai šūnā: Biolistiskās sistēmas (gene gun, biolistic particle delivery system, bioballistic system, biolistic system) izmanto sīkas smago metālu (volframs, sudrabs, zelts u.c.) daļiņas, kuras pārklātas ar pDNS plēvi. Apstrādājamo šūnu virzienā tās tiek raidītas ar liela gāzes spiediena palīdzību. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  37. Transformācija Biolistiskās sistēmas. Sākotnēji metode tika izveidota ar šūnapvalku klāto augu šūnu (sīpola) apstrādei, bet vēlāk tika pielāgota arī mikroorganismu transformēšanai. Metode radās 1980-to gadu vidū. Pirmie pielāgojumi nelielajām mikroorganismu šūnām parādījās ap 1990. gadu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  38. Transformācija Biolistiskās sistēmas. Nepieciešama speciāla iekārta un materiāli. Bio-Rad LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  39. Transformācija Bez "ķīmiskās" apstrādes metodēm aprakstīta virkne citu risinājumu DNS ievadīšanai šūnā: Mazas frekvences ultraskaņa 2000-o gadu sākumā tika pārbaudīta medikamentu ievadīšanai organismā. Nedaudz vēlāk attīstījās ideja par tās izmantošanu DNS ievadīšani eikariotu šūnās. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  40. Transformācija Mazas frekvences ultraskaņa 2007. gadā tā tika veiksmīgi pielietota E. coli un citu, grūtāk transformējamu baktēriju apstrādei, sasniedzot transformācijas biežumu ~ 10-5 transformantu uz šūnu. Song Y., Hahn T., Thompson I., Mason T., Preston G., Li G., Paniwnyk L., Huang W. Ultrasound-mediated DNA transfer for bacteria Nucl. Acids Res. (2007) 35 (19): e129- LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  41. Transformācija Mazas frekvences ultraskaņa Metodē tika izmantota 40 KHz ultraskaņa un parasta sonikācijas vanna, kas paredzēta objektu tīrīšanai (375H /Langford Electronics). Song et al. 2007 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  42. Transformācija Klasiskās "ķīmiskās" apstrādes termošoka soli veicot mikroviļņu krāsnī arī iespējams ~ 5 x uzlabot transformācijas efektivitāti. Yoshida N, Sato M. Plasmid uptake by bacteria: A comparison of methods and efficiencies. Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Jul;83(5):791-8. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  43. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

More Related