Unità monocarboniosa -CH 3 metile -CH 2 - metilene - CHO formile

1. METIONINA FOLATI VITAMINA B12 Unità monocarboniosa -CH3 metile -CH2- metilene -CHO formile Coinvolti nella sintesi di basi puriniche e pirimidiniche, amminoacidi, altri importanticomposti cellulari (creatina, carnitina, colina, …)

2. Amminoacidi solforati COO- I +H3N-CH I CH2 I CH2-S-CH3 metionina Met COO- I + H3N-CH I CH2 I CH2-SH omocisteinaHcy COO- I + H3N-CH I CH2-SH cisteinaCys legame tioetere -CH2-S-CH3 gruppo sulfidrilico -SH Met e Cys nella struttura delle proteine Hcy non entra nella struttura delle proteine ma è indispensabile un intermedio del metabolismo

3. TRANSMETILAZIONE THF metionina S-adenosil metionina X metionina sintasi vit B12 metiltransferasi metil-X omocisteina N5-metilTHF S-adenosil omocisteina creatina quantitativamente più importante colina - fosfolipidi (membrane, VLDL) - neurotrasmettitori (acetilcolina) carnitina adrenalina - istoni -CH3 - citosina -CH3 (controllo epigenetico) + serina cistationina sintasi vit B6 adenosina cistationina vit B6 cisteina TRANSULFURAZIONE

4. metionina + ATP  SAM + 3 molecole fosfato Carenza dell’enzima metionina adenosil transferasi causa persistenti alti livelli di metionina con danni neurologici SH

5. DNA-metiltransferasi • Metilazione della citosina presente in un promotore inibisce la trascrizione: importante per la prevenzione del cancro metilazione degli istoni rende la cromatina compatta, non disponibile alla azione dei fattori di trascrizione Metilazione modifica il genoma senza alterare la sequenza, e permette un adattamento rapido e permanente a modifiche ambientali )

6. L’omocisteina viene ritransformata in metionina ad opera della METIONINA SINTASI (vit B12) • L’enzima non può funzionare in caso di inadeguato apporto di gruppi -CH3 a causa di • mancanza di donatori - folati • carenza del cofattore - metilcobalammina accumulo di omocisteina e bassi livelli di SAM

7. – OOC-CH(NH3+)-CH2-CH2-S-CH2-CH(NH3+)-COO– + H2O  II. L’OMOCISTEINA E’ TRANSFORMATA CISTATIONINA 1° tappa irreversibile - CISTATIONINA  -SINTASI (PLP) Hcy + serina (cistationina -sintasi -vit B6)  cistationina + H2O 2° tappa: CISTATIONINA -LIASI (PLP dipendente) • cisteina + -chetobutirrato + ammoniaca • -chetobutirrato (decarbossilazione ossidativa) propionilCoA succinil CoA

8. CISTEINA • sintesi di proteine • glutatione (Glu-Cys-Gly) (antiossidante) • CoASH (metabolismo acidi grassi) • taurina (SO3--CH2-CH2-NH3+) (formazione dei sali biliari) • zolfo inorganico (sintesi disolfolipidi)

9. interesse per il metabolismo degli amminoacidi solforati • IPEROMOCISTEINEMA • determinata da cause genetiche o nutrizionali • fattore di rischio per • patologie cardiovascolari(indipendente da ipercolesterolemia o ipertensione) • esito infausto per gravidanzaalterazione di sviluppo fetale e neonatale (alterata vascolarizzazione della placenta e quindi diminuita funzionalità: aborto, sottopeso neonatale, difetti tubo neurale,) • sindrome di Alzheimer e altri disturbi neurologici

10. IPEROMOCISTEINEMIA dovuta a • Difetto di rimetilazione della omocisteina a metionina • Difetto di sintesi del 5 metil THF • Difetto nella transulfurazione • Causa o indicatori di malattia? • Evidenziata nel 1962 • Nel sangue : - libera 1-2% • - coniugata a proteine (albumina) • - disolfuri misti Hcy-Hcy; Hcy-Cys • soglia iperomocistinemia = 12 mol/L • valori desiderabili ≤ 9-10 mol/L

11. Meccanismi biochimici del danno vascolare • Ipometilazione • Addotti a gruppi tiolici plasmatici, inibizione enzimi antiossidanti cellulari, stress ossidativo • Alcune conseguenze fisologiche • (endotelio e piastrine) • Aumento della risposta infiammatoria (endotelio) • Alterata funzionalità piastrinica (aumentata sintesi trombossani), • Anormalità della coagulazione e della fibrinolisi • Diminuzione dei livelli di ossido nitrico dovuto a formazione di S-nitroso-Hcy NO ha azione vaso dilatatoria dovuta a rilassamento della muscolatura vasale

12. DIFETTI GENETICI(rari) • cistationina sintasi • metionina sintasi • metilen-THF reduttasi (MTHFR) (carenza o polimorfismo) • NUTRIZIONALI: carenza di B6, B12 o folati • ALTERATA FUNZIONALITA’ RENALEcon dimuita “clearance” • FARMACI CON ATTIVITA’ ANTIVITAMINICAteofillina -usata per l’asma- per la B6 • valproato - usato per la epilessia- per il folato

13. FOLATI • Termine generico che comprende • folati alimentari • si trova prevalentemente • - nei vegetali verdi quali spinaci, asparagi, broccoli • - arance • - legumi, arachidi. • - acido folico presente in supplementi e cibi fortificati • Vitamina scoperta nel 1940 • carenza: anemia megaloblastica • attualmente importante nella prevenzione • sistema nervo ( in particolare sviluppo fetale • cancro (colon)

14. H COOH O H COOH CH2 CH2 N C C N O H CH2 N 4 5 HN 3 6 2 7 1 8 N 2HN N COOH H O II O II 10 OH CH2 CH2 C R N C C N O H n CH2 N HN 5 H H N H N 2HN • THF variabile per Livello di riduzione Catena di poliGlu(1-14) legame peptidico • intrappola la vitamina nella cellula • aumenta l’affinità per gli enzimi • dà specificità enzimatica Sostituzione agli N5 e N10 Forme enzimatiche specifiche metile – CH3 (posizione 5) metilene – CH2 – (posizione 5 e 10) metenile – CH= (posizione 5 e 10) formile – CHO (posizione 5 o 10) pteridina – ac. p-amminobenzoico – ac.glutammico acido folico sintetico supplementi, alimenti fortificati R = unità monocarboniosa tetraidrofolato (THF) cofattore enzimatico nelle fonti alimentari

15. vit B6 metionina glicina  serina dUMP  vit B12 TMP +omocisteina glicina, colina fMet-tRNA mitocondrio FUNZIONI BIOCHIMICHE - Sintesi della metionina dalla omocisteina - Sintesi delle pirimidine (dUMP  TMP)tappa limitante per la replicazione del DNA - Sintesi delle purine metionina sintasi MTHFR FAD, NADPH N5(-CH3)THF N5,N10(-CH2-)THF metilentTHFdeidrogenasi - (NADP) istidina N5N10(-CH=) THF   glutammato THFtetraidrofolato MTHFRmetilenTHFreduttasi TMPtimidilato metenilTHFcicloidrolasi (H2O ) PURINE (C-2, C-8) N10(-CHO)THF formiltTHFsintasi (ATP) - sintesi proteica mitocondriale

16. TRANSMETILAZIONE SINTESI BASI AZOTATE RIMETILAZIONE metionina S-adenosil metionina X vit B6 metionina sintasi vit B12 glicina  serina metiltransferasi MTHFR FAD, NAPH metil-X colina carnitina creatina adrenalina Istoni-CH3 citosina-CH3 + omocisteina  N5,N10(-CH2-)THF N5(-CH3)THF TIMINA vit B6 istidina N5N10(-CH=) THF   glutammato cistationina PURINE N10(-CHO)THF (C-2, C-8) vit B6 TRANSULFURAZIONE cisteina glicina, colina

17. LA FUNZIONE DELLA VIT B12 e’ STRETTAMENTE CORRELATA ALLA FUNZIONE DEL FOLATO Manifestazioni cliniche di carenza di folato e di B12 sono simili TRAPPOLA DEL FOLATO CARENZA SECONDARIA DI FOLATI IN PRESENZA DI CARENZA DI VITAMINA B12 N5-metilTHF deve essere convertito nella forma THF dall’enzima metionina sintasi per poter essere riutilizzato. In alternativa, essendo cattivo substrato per la folilpoliglutammato sintasi, non rimane nella cellula e viene perso con le urine SUPPLEMENTAZIONE DI FOLATI MASCHERALA EVENTUALE CARENZA DI VITAMINA B12

18. ASPETTI CLINICI ANEMIA MEGALOBLASTICACarenza di folati risulta nella inibizione del ciclo cellulare. Anche disturbi gastrointestinali DONNE IN GRAVIDANZA a rischio di sviluppare carenza per l’aumentata richiesta di unità monocarboniosa e sintesi di DNA. rischio di parto pretermine, minor peso alla nascita, fino a complicazioni di gravidanza ed aborto spontaneo DIFETTI DEL TUBO NEURALE sistema nervoso centrale si forma fra il 20° e il 28° giorno dal concepimento dimostrato che la supplementazione con acido folico un mese prima e dopo l’inizio del concepimento (400 ug) previene il rischio nel 70% dei casi Causa ? suggerito ma non dimostrato: - la omocisteina ad alti livelli potrebbe essere neurotossica funzionando da antagonista per il recettore del glutammato, coinvolto nello sviluppo neuronale - alterata metilazione di geni coinvolti nella formazione neuronale MALATTIE CARDIOVASCOLARIdaalti livelli di omocisteina (folati, B6, B12)

19. PREVENZIONE DEL CANCRO • Folato come agente citoprotettivo (carenza associata a cancro) • Regola stabilità DNA tramite due meccanismi principali • uracile timinain carenza: incorporazione errata di uracile nel DNA • S-AdenosilMet metila specifiche citosine DNA (regolazione della trascrizione) • in carenza: ipometilazione CANCRO Cellule cancerose a rapida proliferazione necessitano di folati (antifolati come farmaci) ALCOLISMO CRONICO E CARENZA DI FOLATI: ipotizzato che acetaldeide o l’enzima aldeide ossidasi aumenti l’ossidazione del folato INVECCHIAMENTOCorrelazione tra età e ipometilazione DNA FUNZIONI MENTALI(depressione) Alterazioni nei sistemi di metilazione del sistema nervoso centrale. Associata a bassi livelli di serotonina. Supplementazione di SAM

20. POLIMORFISMO - mutazione presente nell’1% o più della popolazione Il metabolismo del folato coinvolge >30 proteine (enzimi, trasportatori) con diversi polimorfismi N 5,N10METILENE THF REDUTTASI (MTHFR) gene isolato nel 1994 Molto studiata è MTHFR C677T(nella proteina Ala  Val) forma termolabileidentificata nel 1995 in vitro - minore attività e minore stabilità in vivo - può portare ad alterato rapporto delle varie forme metilate del THF, in particolare in carenza di folato Conseguenze: alti livelli di omocisteina Caucausici ed asiatici presentano 12% omozigoti T/T e 50% eterozigoti C/T; africani d’america incidenza più bassa Supplementazione folato (800 g) sembra annullare differenze

21. Principale obiettivo • Prevenzione dei difetti del tubo neurale. • - Campagna indirizzata a tutte le donne in età fertile • DOMANDE • Quanto folato? • Sotto che forma? (sintetico o alimentare). L’alimentazione può fornire sufficienti qualtità di folati? • Polimorfismo MTHFR C677T ? • Un eccesso di folati può aumentare il rischio di cancro? • Un eccesso di folati può esarcebare i danni da carenza di vitamina B12? • USA fissato a 1 mg/dieil livello massimo tollerabile di assunzione di assunzione di acido folico sintetico incluse donne in gravidanza ed allattamento. basandosi sulla evidenza che eccesso di acido folico può esacerbare o far precipitare i danni neurologici dovuti a carenza di B12, dato che l’anemia risponde alla sola supplementazione con acido folico • Problemi negli anziani.

22. Raccomandazioni sull’assunzione(microg/die) Italia USA UK Austria-Germania-Svizzera - Adulto (M,F) 200 400 200 400 Gestante 400 600 300 600 Nutrice 350 500 DONNA In ETA’ FERTILE? • Mean Folate Intake (microg/die) • Country Male Female • ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- • Germany 236 211 • Netherlands 215 173 • Spain 317 303 • Portugal 300 265 • UK 311 213 • Denmark 304 249 • Sweden 230 194 • Ireland 332 260 Paesi Europei Assunzione media in folati nell’adulto relativamente bassa 291 g/d per l’uomo e 247 g/d per la donna

23. Vitamina B12

24. VITAMINA B12 1855 descritta sindrome con anemia megaloblastica e demielinizzazione del sistema nervoso centrale. 1926 dimostrazione che dieta ricca in fegato stimola la produzione di globuli rossi 1948 purificata dal fegato la vitamina B12 (nello stesso anno dalla Merck, Sharp and Dohme e dalla Glaxo) Anemia perniciosa: fatale prima della scoperta della terapia vitaminica • SPERIMENTATA SU PAZIENTI • Modello particolare in quanto • Malattia non complicata da malnutrizione, carenza calorica o carenza di altre vitamine • Mancanza di modelli animali che diano sintomi e alterazioni simili a quelli dell’uomo.

25. STRUTTURA anello tetrapirrolico (corrinico) con uno ione cobalto (Co+3) centrale per cui si definiscono cobalammine (Cbl) i composti con attività B12 CATALISI Co (+3)  Co (+2) • 6° ligando: carbonio (legame covalente) FORME COENZIMATICHE • metile • adenosina 5° ligando: N del dimetilbenzimidazolo (DMB) ribonucleotide in molti SUPPLEMENTI cianocobalammina (- CN) prontamente convertita nelle forme coenzimatiche

26. HO OH I I HC CH CH CH I I O adenina CH3 CH3 2HC N N N N N N Co3+ Co3+ Co3+ N N N N N N N - istidina-Enzima N - DMB N - DMB metilCbl 5’deossiadenosilCbl metil-Cbl legata all’enzima (cofattore)

27. BIOSINTESI • Soltanto dai microrganismi • Le piante non usano B12 • La fonte per animali è il prodotto della sintesi microbica: i ruminanti dai batteri del rumine, gli erbivori da vegetali contaminati da feci gli onnivori - e l’uomo - da prodotti di origine animale

28. FUNZIONE Batteri - in molte reazioni (fra cui sintesi metionina) Animali - note solo 2 reazioni Metionina sintasi (coenzima: metil Cbl) citoplasma 5 metil TH Folato + omocisteina  metionina metil malonil-CoAmutasi (coenzima: adenosil Cbl) matrice mitocondrialemetil malonil~CoA  succinil~CoA

29.  COO- I CH2 I CH2 I CO~SCoA COO- I CH2 + HCO3- + BIOTINA I CO~SCoA propionil ~CoA COO- I HC-CH3 + vit B12 I CO~SCoA metilmalonil~CoA succinil~CoA  IMPORTANTE NEI RUMINANTI: la fermentazione batterica del rumine produce grandi quantità di acido propionico. • Val, Ile, Met, Thr • Acidi grassi a C dispari • colesterolo  ac biliari • Ciclo di Krebs • Metabolismo corpi chetonici • Biosintesi dell’eme

30. Formazione dell’acido metilmalonico in carenza di Vitamina B12 per perdita di CoASH dal metil malonilCOA; di norma non si forma Sintomi peculiari della anemia perniciosa sono gli alti livelli ematici ed urinari dell’acido metilmalonico

31. METABOLISMO Negli alimenti - vit B12 legata sotto forma di coenzima richiede proteine per il trasporto attraverso il tubo digerente e nell’organismo Bocca - secreta la proteina salivare legante la Cbl (aptocorrina o proteina R) Stomaco: pH acido e digestione proteica liberano la vit B12 presente negli alimenti; la vitB12 si lega alla proteina R ed in questa forma va al duodeno Le cellule parietali della mucosa gastrica secernono il fattore intrinseco (IF), proteina altamente specifica per la vit B12 . Duodeno La digestione della proteina R ed ambiente alcalino liberano la vit B12 che si lega al fattore IF (si forma ilcomplesso Cbl-IF) Ileoassorbita mediante due meccanismi 1.endocitosi tramite il recettore specifico per Cbl-IF 2. per diffusione passiva (incide per il 1%.) rilasciata nei lisosomi e legata alla transcobalamina II(TCII) Sangue portale - legata alla transcobalamina II (TCII) Fegato - captata dal fegato per endocitosi e legata alla transcobalamina I(TCI) .

32. MANIFESTAZIONI CLINICHE di CARENZA • Anemia megaloblastica • per diminuita sintesi del DNAche colpisce le cellule in rapida divisione del midollo osseo • Inefficiente eritropoiesi, bassi livelli di eritrociti, globuli bianchi e piastrine (nei casi gravi, anche diagnosi errata di leucemia) • Anormalità neurologiche • Perdita di mielina del sistema nervoso centrale • (non chiari i motivi - gli animali resistenti a questo sintomo) • - Non sempre reversibile, soprattutto se la carenza è presente da lungo tempo • - Più grave nel bambino • alcuni pazienti suscettibili ad anemia, altri ad alterazioni neurologiche • le severità delle due alterazioni sono inversamente correlate • - solo 1/3 dei pazienti con anemia ha alterazioni neurologiche • 1/4 dei pazienti con alterazioni neurologiche ha parametri ematologici normali • Non è chiaro il motivo: le indicazioni metaboliche sono le stesse nei due casi • Disturbi gastrointestinali

33. CAUSE di CARENZA di Vitamina B12 I. MALATTIA AUTOIMMUNE con PERDITA del FATTORE INTRINSECO • Causa più comune di anemia perniciosa • Anticorpi contro la pompa H/K ATPasi e -50% dei casi- anche contro IF • Frequenza F > M (indipendente dall’etnia) •  età (rara nei giovani - 2% sopra i 60 annni) • se scorte sufficienti, occorrono anni perché la malattia si manifesti II. DIFETTI CONGENITI nell’assorbimento e nel metabolismo (rari) - difetti del recettore intestinale per il complesso Cbl-IF - difetti della TCII - alterazioni a livello epatico della sintesi delle forme coenzimatiche • III. CAUSE ALIMENTARI (rare) IV. INVECCHIAMENTOcarenza nel 10-15 % sopra i 60 anni per diminuito funzionamento gastrico e diminuita secrezione gastrica, la vit B12 non viene rilasciata dalle proteine alimentari. V. MALASSORBIMENTO

34. FONTI DI VITAMINA B12 SOLO DA PRODOTTI ANIMALI Fegato di bue - alimento più ricco Carne, pollo, pesce, uova Latte (0.9 ug/ tazza), yogurt, formaggio - buona fonte per vegetariani Fabbisogno adulti = 2,4 microg/d con una dieta normale si introducono 4 - 6 microg/die