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TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA

TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA. Indice. 1. Introducción: la clonación molecular 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo 5. Métodos de selección

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TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA

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  1. TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA

  2. Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Obtención de genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

  3. 1. Introducción: la clonación molecular La clonación consiste en la obtención de un clon, entendido como un conjunto de elementos genéticamente iguales entre si e iguales a su precursor. - Amplificación de moléculas de ADN por clonación célular • Amplificación de moléculas de ADN por clonación acelular (PCR) - Manipulación genética y clonación de organismos pluricelulares (animales y plantas)

  4. 1. Introducción: la clonación molecular ... ¡¡ Dios mío, me han clonado... !!

  5. Extraer el gen de interés insulina 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación

  6. Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Obtención de genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

  7. Stanley Cohen (Universidad de Stanford) Plásmidos bacterianos 1. Introducción: la clonación molecular Aislamiento y digestión del ADN • Herbert Boyer (Unversidad de Columbia) Enzimas restricción Inserción en moléculas vectores . con capacidad autónoma de replicación en la célula hospedadora

  8. Fosfodiesterasa de veneno de serpiente 2. Las enzimas de restricción Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Exonucleasas: atacan por un extremo determinad de la cadena nucleotídica • exonucleasa a o 3’ • exonucleasa b o 5’ Endonucleasas: atacan de forma selectiva una secuencia nucleotídica Enzimas de restricción

  9. 2. Las enzimas de restricción EcoRI actuando sobre una secuencia de ADN

  10. 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

  11. 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Tipo I y Tipo III  Actividad restricción y modificación  Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina  Reconocen una secuencia específica  Recorren un cierto número de bases y cortan Tipo II  Rompen por la secuencia de reconocimiento  Precisan Mg 2+, pero no ATP

  12. C C G G G G C C 2. Las enzimas de restricción Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Ejemplos de endonucleasa extremos cohesivos 5’ 3’ G↓A A T T C C T T A A↑G 3’ 5’ extremos romos

  13. A A G C T T Hind III de T T C G A A Haemophilus influenza 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN EcoR 1 de E.coli G A A T T C Secuencias Palindrómicas C T T A A G

  14. 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN EcoR 1 de E.coli Secuencias Palindrómicas G A A T T C Extremos cohesivos C T T A A G

  15. 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Métodos de aislamiento de ADN foráneo (a) Cortes: • Endonucleasas de restricción (Tipos I, II, III) • Fragmentación mecánica • Síntesis de DNA a partir de RNAm: Transcriptasa reversa • Síntesis química directa (b) Síntesis

  16. 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa ADN cDNA transcripción ARN polimerasa Transcriptasa reversa ARN traducción PROTEÍNA RNA La mayoría de las células RNA Retrovirus

  17. 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa

  18. Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

  19. 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector Vector de clonación 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

  20. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Vectores de clonación Son vehículos de ADN para ADN,capaces de recibir ADN foráneo y replicarlo. Características principales • Se replican de forma autónoma (origen de replicación) • Contienen regiones no esenciales para su multiplicación y estabilidad

  21. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN • Tipos de vectores: • Plásmidos • Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son más eficaces con insertos más pequeños (<10kb). • Contienen genes de resistencia a antibióticos. • Virus • Permiten insertar 15-20 kb. • El sistema de infección del virus permite la entrada del ADN en E. coli. • Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones especiales para secuenciar y realizar mutagénesis. • Vectores híbridos: cósmidos. Permiten insertar hasta 40 kb.

  22. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación • Plásmidos (bacterianos) • Virus • Cósmidos (laboratorio) • YACs (levaduras)

  23. ADN Plasmídico ADN ADN Plasmídico 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN • Plásmidos pBR322 -Control relajado -Fenotipo seleccionable -Cierto Nº de sitios de restricción -Bajo PM (4 363 bp) (transformación con plásmidos 10000bp es poco eficiente

  24. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación • Plásmidos (bacterianos) • Virus • Cósmidos (laboratorio) • YACs (levaduras)

  25. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad que poseen para introducir el ADN foráneo en la célula hospedadora • Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 • Para plantas: CaMV • Para mamíferos: SV40

  26. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Fago l • Virus • -El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cápsida puede hacerse in vitro. La cápsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l). • Se introduce en la bacteria hospedadora por transducción

  27. Adsorción de particulas virales a una bacteria

  28. SIDA

  29. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación • Plásmidos (bacterianos) • Virus V • Cósmidos (laboratorio) • Mezcla plásmido y virus • YACs (levaduras), contienes sitios característicos de la funcionalidad de los cromosomas

  30. Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

  31. 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

  32. 3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN Enzimas de restricción Vector ADN

  33. Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

  34. 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

  35. W, Au 4. Hospedadores. Introducción del ADN foráneo Métodos de inserción del ADN-vector en célula huesped • Transformación: ADN plasmídico en célula. CaCl2 (mejora el proceso). Para plásmidos < 20 Kb • Infección:directa del virus empaquetado in vitro • Transducción: ADN vírico sin cápsida (menor rendimiento) • Microinyección: para células grandes (eucariotas) con micromanipulación. • Pistola o Bombardeo de partículas:para transformar vegetales. • Conjugación: celular del ADN de dos células • Fusión de Protoplastos: intercambio ADN, dos células sin pared celular

  36. Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

  37. 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

  38. 5. Métodos de selección • MÉTODOS DE SELECCIÓN • Resistencia a antibióticos • Genes marcadores (gen b-galactosidasa) • GFP (green fluorescent protein) • Hibridación de colonias

  39. El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina 5. Métodos de selección • Resistencia a antibióticos La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina Plásmido pBR322

  40. Con plásmido Sin inserto Con plásmido Con inserto Sin plásmido Sin inserto 5. Métodos de selección • Resistencia a antibióticos La resistencia la confieren genes que porta el vector Con ampicilina y tetraciclina Con tetraciclina

  41. 5. Métodos de selección • MÉTODOS DE SELECCIÓN • Resistencia a antibióticos • Genes marcadores (gen b-galactosidasa) • GFP (green fluorescent protein) • Hibridación de colonias

  42. Gal Amp Ori pUC19 5. Métodos de selección • Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa) 5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido  Br-Cl-indol + galactosa (X-gal) (Azul) • Inactivación insercional (introducir el DNA foraneo en el medio del marcador) • Inserción génica positiva (Unir el gen marcador al DNA foraneo)

  43. Gal Amp Ori Plasmido pUC19 5. Métodos de selección • Genes marcadores (gen b-galactosidasa) Gal +inserto Amp Ori Plasmido pUC19

  44. 5. Métodos de selección pUC19 = plásmido b-galactosidasa + ADN foráneo b-galactosidasa X

  45. 5. Métodos de selección • MÉTODOS DE SELECCIÓN • Resistencia a antibióticos • Genes marcadores (gen b-galactosidasa) • GFP (green fluorescent protein) • Hibridación de colonias

  46. 5. Métodos de selección • GFP (green fluorescent protein)

  47. Vector Localización Excitación (nm) Emisión (nm) GFP-ACTIN Actina 488 510 CFP-GOLGI Ap. De Golgi 420 475 GFP-ENDO Endosomas 488 510 M-GFP Membrana 488 510 RFP-MITO Mitocondria 550 600 CFP-MITO Mitocondria 420 475 YFP-NUC Núcleo 515 530 GFP-PEROXI Peroxisomas 488 510 YFP-ER Retículo endoplásmico 515 530 GFP-TUB Tubulina 488 510 5. Métodos de selección • GFP (green fluorescent protein)

  48. 1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

  49. Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

  50. Genotecas • Genoteca: colección de clones que contiene todo el genoma de un organismo. • Tipos de genotecas: • Genómicas • Parciales • ADNc. Colección de ARNm • Tipos de vectores: • Plásmidos (Genotecas parciales) • Fagos (Genotecas genómicas pequeñas y de ADNc) • Cósmidos, BAC (genotecas genómicas complejas)

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