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PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIO INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE TP53 NO CÂNCER DE MAMA E NA

PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIO INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE TP53 NO CÂNCER DE MAMA E NAS LESÕES MAMÁRIAS PRÉ-NEOPLÁSICAS. Câncer de Mama. Câncer de Mama. No mundo: segunda neoplasia maligna USA: 180 mil novos casos por ano uma em cada oito mulheres

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PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIO INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE TP53 NO CÂNCER DE MAMA E NA

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  1. PESQUISA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO NO CARCINOMA MAMÁRIOINVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO DO GENE TP53 NO CÂNCER DE MAMA E NAS LESÕES MAMÁRIAS PRÉ-NEOPLÁSICAS

  2. Câncer de Mama

  3. Câncer de Mama • No mundo: segunda neoplasia maligna • USA: 180 mil novos casos por ano • uma em cada oito mulheres • Parkin et al, Eur J Cancer 2001. • National Center for Health Statistics, 1998.

  4. Câncer de Mama no Brasil • Principal causa de morte por câncer em mulheres • Previsão para o ano de 2003: • casos novos: 41.610 (46,35/100.000 mulheres) • óbitos: 9.335 (10,40/100.000 mulheres) • INCA, 2003

  5. Mortalidade por Câncer no Brasil de 1979-2003

  6. Câncer de Mama no Brasil • RS: terceiro do país em incidência • 52,2 casos novos/ 100.000 mulheres • RJ: 103,89 /100.000 • SP: 78,69/100.000 • INCA, 2003

  7. Etiologia • Etiologia desconhecida • Fatores hereditários = 5% • Vários fatores de risco • Patogênese complexa • Estudos para definição etiológica

  8. Lesões Mamárias Pré-neoplásicas • Precursoras do carcinoma mamário • Modelo de evolução ainda indefinido • alterações genéticas favoráveis • Syngletary, J Am Coll Surg 2002

  9. Lesões Mamárias Pré-Neoplásicas • Hiperplasia epitelial típica (risco 2 vezes maior) • Hiperplasia epitelial atípica (risco 5 vezes maior) • Carcinoma in situ (risco 10 vezes maior) • Page et al, J Natl Cancer Inst 1978; London, JAMA 1992; Dupont, Cancer 1993

  10. PAPILOMAVÍRUS HUMANO • Vírus DNA • Mais de 100 tipos identificados • Tipos são classificados conforme homologia na seqüência de DNA e associação com lesões clínicas • Sisk & Robertson, Front Biosci 2002

  11. PAPILOMAVÍRUS HUMANO • Mucosos: 11, 6, 16, 18, 31, 33, 52 • Epidermodisplasia verruciforme: 14, 19, 29, 46 • Cutâneos: 1, 63, 60, 65, 41 • zur Hausen & Villiers. Annu Rev Microbiol 1994

  12. Vias de infecção • Contato/ Sexual • Transplacentária • Hematogênica • Strauss et al. Sex Trans Infect 2002; Syrjanen &Puranen. Crit Rev Oral Biol Med 2000

  13. Formas de infecção • Latente • Proliferativa • Oncogênica

  14. Ação do HPV na célula • Lesões benignas - epissomal • Lesões malignas- freqüentemente integrado ao genoma do hospedeiro • Aumento da expressão dos genes E6 e E7 • Wolf & Ramirez, Cancer Invest 2001

  15. Mecanismo oncogênico do HPV • E6 - degrada a proteína p53 pela via da ubiquitina • p53: parada do ciclo celular e/ou apoptose sempre que há um dano no DNA • Farthing & Vousden, Trends in Microbiol 1994

  16. Mecanismo oncogênico do HPV • E7 - modifica a estrutura da proteína Rb • pRb = responsável pela manutenção do ciclo celular quiescente. • Acúmulo de mutações genéticas e imortalização celular Sisk & Robertson, Front Biosci 2002

  17. Papel oncogênico do HPV • Fator causal essencial para o desenvolvimento de neoplasia do colo uterino • Detecção de DNA viral em 99,7% dos casos • International Agency for Research on Cancer, 2000

  18. Papel oncogênico do HPV • Importante fator de risco para outras neoplasias da região anogenital: 50 % • Câncer anal: incidência de 88 % • Sturgeon et al. Am J Obstet Gynecol 1996; Frisch et al. N Engl J Med, 1997

  19. HPV e carcinoma mamário • Presença de DNA do HPV16 em 46% das 38 pacientes com carcinoma mamário e história prévia de NIC III • Possível disseminação hematogênica viral • Hennig et al. Breast Cancer Res and Treat, 1999

  20. PCR • Processo que inclui três etapas: • Desnaturação • Anelamento • Extensão • Amplificação exponencial do fragmento alvo

  21. PCR • Iniciadores ou primers: seqüência conhecida deoligonucleotídeos com 20-25 pares de bases • Primer consenso: MY09/MY11, amplifica L1 • amplifica mais de 25 tipos de HPVs • menor sensibilidade do que os primers específicos • Primer específico: amplifica região específica de um determinado HPV (E6)

  22. Metodologia • Análise dos resultados: gel de agarose a 1,5 % • Visualização com luz ultravioleta a partir da incorporação de brometo de etídio • primers consenso: 450 pares de base (pb) • primers específicos: 380 pb para HPV16 e 440 bp para HPV 18 • primers ß-globina: 280 bp

  23. Resultados • 101 pacientes com câncer de mama • 41 pacientes controles • 21 pacientes com fibroadenoma • 20 pacientes com hiperplasia gordurosa

  24. Resultados • 25 casos de carcinoma positivos (24,75%) • 15 casos (60%): positivos para HPV16 • 11 casos (40%): positivos para HPV18 • Um dos casos foi positivo para os dois tipos virais • Nenhum caso do grupo controle foi positivo para HPV

  25. Gene TP53 • Cromossoma 17p13 • Li-Fraumeni • proteína p53: apoptose e/ou parada do ciclo celular • alteração: instabilidade genômica • Malkin et al, Science 1990; Dickson & Lippman, Diseases of the Breast 2000.

  26. Polimorfismo do gene TP53 • Aumento de risco para o desenvolvimento de carcinomas • Polimorfismo: ocorrência de múltiplos alelos num lócus, onde pelo menos dois alelos aparecem com freqüências superiores a 1% em determinada população

  27. Polimorfismo do códon 72 do exon 4 • Translação de uma Arginina (Arg) ou uma Prolina (Pro) - CGC/ CCC • Maltlasheweski et al, Mol Cell Biol 1987; Wang et al Int J Mol Med 1999

  28. Alteração estrutural • Mudanças funcionais • Variante Arg mais efetiva na promoção da apoptose • Aumento de susceptibilidade à degradação pela proteína E6 do papilomavírus humano (HPV) • Maltlasheweski et al, Mol Cell Biol 1987; Dumont et al, Nat Genetics 2003; Thomas et al, Mol Cell Biol 1999.

  29. Variações étnicas e climáticas • Alelo Pro: variações de freqüência de 17 a 63% • Mantido por seleção natural • Beckman et al, Hum Hered 1994.

  30. Carcinomas associados ao polimorfismo do TP53 • Aumento de risco para portadores do alelo Pro: - cabeça e pescoço - pulmão • Aumento de risco para portadores do alelo Arg: - bexiga - pele não-melanoma • Weston et al, Cancer Epidemiol Biomark Prev 1992; Shen et al Cancer Lett 2002; Soulitzis et al Cancer Lett 2002

  31. Associação mais significativa • HPV: carcinoma de colo de útero • Risco 7 vezes maior de desenvolver carcinoma • Alelo Arg • Storey et al, Nature 1998

  32. Estudos posteriores com resultados controversos • No Brasil apenas um estudo • Associação de risco importante - Arg • OR: 8,0 (95% CI: 2,3-28,5) • OR: 21,5 (95% CI: 3,4-137, 8) • Variação inter-laboratorial • Makni et al, Int J Cancer 2000.

  33. Câncer de Mama • Sete trabalhos na literatura indexada • Resultados controversos • Tendência de aumento de risco com alelo Pro • Kawajiri et al, Carcinogenesis 1993; Sjalander et al, Carcinogenesis 1996; Weston et al, Cancer Epidemiol Biomark Prev 1999; Papadakis et al, Mol Cell Biol Res Commun 2000; Keshava et al Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; Langerod et al Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; Suspitsin Int J Cancer 2003; Buyru Oncol Rep 2003.

  34. Justificativas • Ausência de trabalhos que determinem o tipo de polimorfismo da população brasileira • Primeiro a ser realizado em lesões pré-neoplásicas • Alta incidência de infecção pelo HPV e de carcinoma mamário na nossa região • Estudo prévio: prevalência da infecção pelo HPV de 25% no câncer de mama em nosso meio

  35. OBJETIVOS • Objetivo principal • avaliar a presença do polimorfismo do códon 72 no exon 4 do gene TP53 nas pacientes portadoras de carcinoma mamário e nas pacientes portadoras de lesões mamárias pré-neoplásicas

  36. Objetivos secundários • correlacionar o polimorfismo do gene TP53 com as seguintes variáveis clínico-patológicas: • idade • raça • antecedentes ginecológicos • tipo histológico • grau histológico • estadiamento tumoral • presença de HPV no carcinoma mamário • comparar o polimorfismo do gene TP53 nas pacientes com câncer com os achados em pacientes com lesões mamárias pré-neoplásicas e controles saudáveis.

  37. Grupo controle • indivíduos doadores do Banco de Sangue da ISCMPA • sexo feminino • randomização pela idade

  38. Amostras • Veno-punção: pacientes • doação: controles • 2 ml sangue total • vacutainer com citrato de sódio • extração do DNA das amostras

  39. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO DE FRAGMENTOS POLIMÓRFICOS • ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO • SEPARAÇÃO POR ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE • LEITURA EM LUZ U-V

  40. Enzimas de restrição • Enzima BstUI • Prolina não clivada • 199 pb • Arginina clivada em 2 fragmentos • 113 pb • 86 pb

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