Il campionamento degli alimenti per indagini microbiologiche

1. Il campionamento degli alimenti per indagini microbiologiche dott. Francesca Giacobbi Sezione Provinciale di Bologna Dipartimento Tecnico

2. Negli ultimi trent’anni l’incidenza delle malattie trasmesse da alimenti è aumentata progressivamente in tutti i paesi industrializzati ed il fenomeno è considerato un importante problema di sanità pubblica.

3. Nel trentennio 1965-95 i casi di salmonellosi per 100’000 abitanti sono passati da 9 a 18

8. Evoluzione dei modelli preventivi applicati al controllo ufficiale degli alimenti Trend epidemiologici degli ultimi 30 anni

9. Il primo modello preventivo applicato dagli inizi del '900, il “modello repressivo”, consisteva nel: prelevare campioni alla vendita, compiere le analisi microbiologiche, mettere in opera misure di correzione in caso di esito sfavorevole.

10. Il “modello repressivo” risulta non soddisfacente per almeno tre ragioni: 1) il campionamento di un lotto (*) apporta informazioni significative solo se viene eseguito in modo rappresentativo: il numero di campioni prelevati deve essere calcolato tenendo conto che la distribuzione dei microorganismi nel lotto stesso non è di tipo normale ma è una distribuzione di Poisson. (*) lotto = insieme di unità di vendita fabbricate o confezionate in circostanze praticamente identiche ossia stesso giorno, stessa linea di produzione senza interruzione di continuità

12. (segue) 2) nel caso i risultati delle analisi dimostrino difetti o non conformità, il problema pesa completamente sul produttore e/o distributore rendendo pertanto impossibile identificare altre eventuali responsabilità lungo l'intero percorso che il campione subisce fino al momento della vendita 3) nel caso il controllo evidenzi che l'alimento esaminato non è salubre è possibile e probabile che sia già stato commercializzato

13. L’evoluzione del modello: le GMP Tra il 1930 e il 1950 Meyer xx , Wilson xx e Buttiaux xx introducono l'applicazione delle GMP (Good Manufacturing Practices) che consistono nella: - identificazione dei punti critici nella catena di produzione e distribuzione - riduzione/eliminazione dei rischi con misure di controllo - verifica della loro efficacia "dalle materie prime al prodotto in tavola”: Longitudinally Integrated Safety Assurance (LISA).

14. (segue) il modello è efficace se si attiene alla triade di Wilson: 1a tappa: ridurre al massimo il livello dei patogeni attraverso la selezione della materia prima di miglior qualità; assicurare le misure di igiene nella fase di produzione 2a tappa: evitare la contaminazione del prodotto con idoneo confezionamento 3a tappa: prevenire la moltiplicazione durante la distribuzione e la conservazione, ad esempio con una efficace refrigerazione ininterrotta

15. I limiti del modello che applica le GMP - qualitativo in quanto non è operato attraverso un'analisi ponderale del pericolo - soggettivo in quanto è assente un monitoraggio predeterminato in linea - specie aspecifico in quanto non è applicato in relazione alla specificità della produzione

16. HACCP GMP

18. I vantaggi del modello che applica l‘HACCP - quantitativo in quanto è operato attraverso un'analisi ponderale del pericolo - oggettivo in quanto ogni fase sotto controllo è vincolata a criteri prestabiliti, monitorata in continuo (on-line, off-line), documentata e periodicamente verificata - specie specifico in quanto è applicato in relazione alla specificità della produzione

19. Le fasi della VERIFICA - CAMPIONAMENTO (materie prime, intermedi di lavorazione e prodotto finito) - audit del personale - osservazione delle modalità comportamentali del personale stesso mentre svolge la normale attività - misurazione di parametri chimico fisici individuati nei criteri a livello dei CCP - valutazione della congruità di tutta la documentazione

20. In microbiologia non è semplice garantire la rappresentatività di un campione in quanto la distribuzione dei microrganismi all’interno di un alimento (sia deterioratori che patogeni) non è normale, ovvero non è omogenea, in quanto i microrganismi tendono ad occupare nell’alimento posizioni che presentano caratteristiche chimiche, fisiche, nutrizionali ideali per la loro crescita e sviluppo.

24. Qual'è il numero di campioni da prelevare ai fini di eseguire un campionamento rappresentativo? Il numero di campioni deve essere stabilito sulla basi di modelli statistici applicati quando la distribuzione dei microrganismi è disomogenea, ai fini di eliminare l'effetto della colonizzazione stratificata.

26. I RISCHI DEL PRODUTTORE RELATIVAMENTE ALL’ACCETTAZIONE DEL LOTTO I RISCHI DEL PRODUTTORE RELATIVAMENTE AL RIGETTO DEL LOTTO 60

27. Il numero di campioni “n” da esaminare è legato al tipo di microrganismi che si devono ricercare o, meglio, è legato al tipo di pericolo sanitario (gravità) che la presenza del microrganismo nell'alimento comporta.

28. Sono stati individuati 5 livelli di gravità del pericolo, così suddivisi: - pericolo assente (deterioramento e vita di scaffale) - pericolo basso indiretto (organismi indicatori) - pericolo moderato diretto a diffusione limitata (es. intossicazione da Staphilococcus aureus o da Bacillus cereus) - pericolo moderato diretto a diffusione potenzialmente ampia (es. salmonellosi) - pericolo elevato acuto (es. botulismo, colera)

29. I lL RIGORE DEI PIANI DI CAMPIONAMENTO AUMENTA ALL’AUMENTARE DEL PERICOLO 60

30. In ogni piano di campionamento, oltre ad essere indicato il numero “n” di campioni che devono essere analizzati, deve anche essere indicato il numero massimo “c” di campioni che possono essere accettati.

32. m = valore guida al di sotto del quale il campione viene accettato senza alcuna riserva M = valore limite al di sopra del quale il campione viene rigettato senza alcuna riserva c = numero massimo di campioni che possono avere valori compresi tra m e M

33. Sulla base di: - n = numero di campioni da prelevare all'interno del lotto - piano di camionamento a 2 o 3 classi - c = numero massimo di campioni che possono avere valori compresi tra m e M i piani di campionamento dovranno essere effettuati secondo questa classificazione.

36. I campioni devono essere prelevati utilizzando un “criterio random” Facciamo un esempio pratico per individuare n campioni da un lotto di 600 confezioni: - si numerano le confezioni progressivamente dal n. 1 al n. 600 - si punta la penna a caso sulle tavole - in quel punto viene scelto il numero di 3 cifre che individua il primo campione (3 cifre perché tante sono quelle del lotto, 4 cifre per lotti fino a 9999 pezzi oppure 2 cifre per lotti fino a 99 pezzi e così via)

37. (segue) - dal punto individuato si scende alla riga sottostante: il numero corrispondente individua il secondo campione - così via fino ad ottenere gli n (da 5 a 60) campioni - nel caso si ottenga un numero superiore al quantitativo del lotto (ad esempio 931), il valore viene scartato e con il criterio descritto si sceglie il valore successivo

39. Modalità per prelevare un campione: metodo dei quarti - servendosi di utensili sterili o disinfettati prelevare un quantitativo di alimento 5 volte superiore a quello stabilito e lo riporlo all'interno di un sacchetto sterile - mescolare il campione all'interno del sacchetto di campionamento in modo da omogeneizzarlo - porre il sacchetto su di una superficie piana e stendere il contenuto fino a raggiungere un sottile strato

40. (segue) - dividere la massa in quattro quadranti utilizzando una spatola - i quadranti 1 e 3 vengono riposti in un altro sacchetto mentre i quadranti 2 e 4 vengono esclusi - questa procedura si ripete da capo però in questo caso saranno tenuti i quadranti 2 e 4 mentre verranno esclusi i quadranti 1 e 3

41. Le operazioni da compiere successivamente sono le seguenti: - registrare la temperatura del locale, del frigorifero o dell'apparecchiatura per la conservazione a caldo dove lo stesso è conservato - misurare la temperatura del campione mediante una sonda o un termometro - gli alimenti deteriorabili vanno refrigerati tra 0 e 4°C e mantenuti in queste condizioni fino al momento dell'analisi: se il campione è caldo bisognerà raffreddarlo con acqua corrente o ghiaccio. I campioni non vanno mai congelati

42. (segue) - rendere il campione univocamente identificabile con idoneo cartellino ed eventuale piombatura - mantenere la temperatura costante durante il trasporto in contenitori termicamente isolati (frigoriferi portatili) - il Laboratorio di analisi è tenuto ad accettare soltanto i campioni prelevati e trasportati correttamente - le analisi andrebbero condotte entro le 24 ore successive

43. Attrezzatura necessaria per il campionamento (Bryan, 1987) - Contenitori sterili per i campioni: buste di plastica sterili a perdere (tipo "stomacher"), contenitori a collo largo con tappo a vite (capacità 150-1000 ml), contenitori metallici con coperchi a chiusura ermetica - Utensili in confezioni sterili per la raccolta dei campioni: cucchiai, mestoli, coltelli da macellaio, pinze, pinzette, spatole, punte da trapano, pipette, forbici, tamponi, spugne, tamponi di Moore (blocchetti di garza ottenuti ripiegando più volte delle strisce di garza)

44. (segue) - Agenti di sterilizzazione: lampade flambatrici a gas, etanolo al 95% - Prodotti e mezzi per la refrigerazione: refrigeranti commerciali in buste di plastica, sostanze liquide in barattoli, borse di gomma o di plastica pesante da potere riempire con acqua e poi congelare, borse di plastica pesante per ghiaccio, ghiaccio in barattoli

45. (segue) - Attrezzatura generale: pennarelli a punta fine indelebili, rotolo di nastro adesivo, cotone, trapano elettrico (per prelevare prodotti congelati), fiammiferi, portaprovette, contenitori di materiale isolante, moduli per la registrazione dei campioni - Abbigliamento: camici, copricapo, guanti e sovrascarpe di plastica a perdere.

46. Quali microrganismi ricercare negli alimenti campionati ? Nel 1977 Ingram e Mossel introdussero in campo alimentare l’uso di batteri “marker”, la cui ricerca informasse non tanto sulla salubrità diretta del prodotto quanto sul processo con cui il prodotto era stato trattato e sulla probabilità che il prodotto potesse albergare germi patogeni.

47. Caratteristiche dei batteri “marker” - essere rappresentativi del tipo di processo cui è stato sottoposto l’alimento in esame - essere presenti nell’alimento in quantità tale da non costituire problemi per la ricerca - essere semplici da ricercare - avere metodologie di ricerca poco costose

48. Indicatori di processo Gli indicatori di processo informano in merito alle procedure cui l'alimento è stato sottoposto (manipolazione, stato di conservazione, trattamenti termici, ecc.). Esempi: - conta dei germi mesofili aerobici - conta dei germi psicrofili - Enterobacteriaceae - coliformi (gruppo) - Enterococcus (gruppo) - stafilococchi coagulasi e termonucleasi +

49. Indici di salubrità Gli indici di salubrità informano in merito alla possibile presenza di germi patogeni. Esempi: - Escherichia coli -Staphilococcus aureus

50. Valori target di riferimento Sono ricavati da: 1) norme italiane e/o europee: citano valori cogenti, da non superare che dovrebbero essere emanati sulla base d'indagini conoscitive su alimenti finiti prodotti rispettando le GMP, l’HACCP, la QRA Esempi di norme verticali sono: D.P.R.n.54 del 14/1/1997 in materia di produzione e immissione sul mercato di latte e prodotti a base di latte