BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 5

1. CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 5 http://users.unimi.it/mpl/lezioni.html

2. ChIP-on-chip (o ChIP-chip) è una tecnica che combina la immunoprecipitazione di cromatina (chromatin immunoprecipitation"ChIP” con la tecnologia del micro array(microarray technology “chip").

4. read-out Normalizzazione dei dati e analisi esplorativa dei dati Sito DNA “estrazione delle informazioni” arricchimento proteina di interesse

5. Le prime analisi si sono focalizzate sulle differenze tra animali in Proestro e Metestro, per vedere se la differenza dei livelli di Estradiolo circolante avesse degli effetti sull’espressione genica. Come atteso, gli animali LID non mostrano nessuna significativa differenza nell’espressione genica nelle due fasi del ciclo, come se quest’ultimo fosse appiattito. Gli animali WT, al contrario, mostrano deboli ma rilevabili differenze nelle due fasi; tuttavia, il quadro osservato e’ totalmente inatteso, in quanto i geni differenzialmente espressi sono tutti geni MAGGIORMENTE espressi nella fase di metestro o, guardando all’inverso, downregolati nella fase di Proestro. Considerando cio’ che abbiamo sempre osservato, vale a dire un’attivazione del recettore degli estrogeni in fase di proestro, questo stupisce. Upregulated in M WT M vs WT P WT P vs WT M SEM Analysis Downregulated in P

6. GO Term Analysis • Una volta identificati i trascritti differenzialmente espressi nei due gruppi (t test & SAM analysis, tenendo in considerazione solo quelli con Fold Indution >=1,5), si cerca di capire se questi geni sono implicati in determinati ‘Biological Process’ o hanno particolari ‘Molecular Function’ o interferiscono in un determinato ‘Pathway’. • Questa analisi si puo’ fare a diversi “livelli”, i risultati riportati si riferiscono ad un livello piuttosto superficiale, ma per questo piu’ generale e credo indicativo. • Riporto: • BP = Biological Process • MF = Molecular Function • Pathway • L’analisi e’ stata fatta principalmente con • http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp • piu’ molti altri software e websites (le risorse sono infinite)

7. Biological Process - WTall vs LIDall Considerando tutti i trascritti differentemente espressi, sia upregolati che downregolati. I geni per ogni categoria sono nel file Excel ‘Panther_BP_WTall_vs_LIDAll.xls’

8. Molecular Function - WTall vs LIDall I geni per ogni categoria sono nel file Excel ‘Panther_MF_WTAll_vs_LIDAll.xls’

9. I LIMITI DELLA ANALISI GENOMICA: RIPRODUCIBILITA’ ANALISI NON QUANTITATIVA I mRNA NON RIFLETTONO ESATTAMENTE LE PROTEINE PRESENTI NELLA CELLULA

10. proteomica Il fine dellaproteomicaconsistenellacompletaidentificazionedelleproteine e dellaloroespressione in determinati cellule o tessuti La metodologiasu cui sibasa la proteomicacomprende: gel elettroforesibidimensionale; HPLC e spettrometriadimassa

11. (20,000 to 25,000 genes vs. > 500,000 proteins). • E’ statocalcolatocheilcorpoumanopuo’ esprimerefino a 2 milionidiproteine, ciascuna con differentifunzioni

12. I metodi della proteomica • dagli anni ‘70: gel elettroforesi bidimensionale Limiti di definizione e riproducibilità • Anni ’90 spettrometria di massa • con metodi di ionizzazione alternativi (electrospray o MALDI Matrix Assisted Laser DesorptionIonization) Non si amplificano le proteine: dimensione campioni Identificazione dei peptidi da miscele complesse Rapidità Analisi quantitativa Limiti nelle conoscenze di genomi da diversi organismi Disponibilità di strumentazione

13. electrospray ionization liquid chromatography mass spectrometry

14. John Bennett Fenn ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 2002 per lo sviluppo della tecnica di elettrospray per l’analisi di macromolecole biologiche

15. Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) per analisiproteomicaquantitativa

17. Functional and quantitative proteomics using SILAC SILAC (Stable isotope labelling with amino acids in cell culture) Mann Nature Reviews Molecular Cell Biology7, 952–958 (December 2006) | doi:10.1038/nrm2067

18. Proteomica e trascrittomica a confronto Uno studio in cui si sono comparati i dati di analisi di cellule MCF-7 Su un totale di 7278 geni identificati in modo univoco come messaggi o proteine 55% provengono da analisi proteomica 77% provengono da microarray

19. LE PROSPETTIVE DELLA PROTEOMICA: • continuo progresso della tecnologia per misure sempre più su larga scala e rapide • costruzione di banche dati • protomica interviene in cellule dove mRNA non è informativo (es cellule ematiche) • La misura proteomica fornisce l’end point, il microarray va verificato con qPCR e da western • La proteomica permette di studiare la presenza di modificazioni post-traduzionali, di interazioni proteina-proteina

21. INTERATTOMICA analisi del trascrittoma, del proteoma e dell’interattomacomparati per arrivare a definire le funzionifisiologichediciascun gene

22. L’INTERATTOMA O BIOLOGIA DEI SISTEMI (system biology)

23. L’interattomarappresentainterazionimolecolari con un sistemadigrafico Per grafico intendiamo un insieme di punti, nodi o vertici che sono tra loro collegati non in modo unidirezionale. Nel digrafico la direzionalità o bidirezionalità dell’evento è segnata

25. Gene Ontology http://www.geneontology.org/index.shtml Un progetto atto a costruire un vocabolario per descrivere geni e prodotti genici attribuibili a ogni organismo Questo vocabolario serve per dare un unico nome a un specifico prodotto in modo che questi così compaia nelle diverse banche dati e possa venire rapidamente ritrovato

26. L'ontologia, una delle branche fondamentali della filosofia, è lo studio dell'essere in quanto tale, nonché delle sue categorie fondamentali. Il termine deriva dal greco ὄντος, òntos (genitivo singolare del participio presente ὤν di εἶναι, èinai, il verbo essere) più λόγος, lògos, letteralmente "discorso sull'essere”

27. Gene Ontology Potenziamento dell'interoperabilità delle banche dati biologiche mediante la standardizzazione della terminologia biochimica e l'introduzione di un'ontologia condivisa Combinazione dei diversi punti di forza di gruppi europei attivi in vari ambiti della normalizzazione per la terminologia biochimica all'interno delle banche dati, allo scopo di sviluppare e applicare un vocabolario controllato e un'ontologia comune per la descrizione degli attributi biologici nelle banche dati biologiche

28. Gene Ontology http://www.geneontology.org/index.shtml • Ogni gene/proteinasicontraddistingue per un numeroidentificativounico (GO:nnnnnnn) e un nome(es: cellula, fibroblasto, fattoredicrescita, trasduttore del segnale). • Ogniterminevieneassegnato a unadelletresuddivisionidellabanca (ontology): • Funzionimolecolari • Componenticellulari • Componenti I processibiologici

29. Gene Ontology (GO, ontologia genica): un vocabolario controllato e strutturato per la descrizione di prodotti genici in termini • di funzione molecolare, • di ruolo biologico e • di ubicazione cellulare

30. A gene product might be associated with or located in one or more cellular components; it is active in one or more biological processes, during which it performs one or more molecular functions. For example, the gene product cytochrome C can be described by: the molecular function term oxidoreductase activity, the biological process terms oxidative phosphorylation and induction of cell death, and the cellular component terms mitochondrial matrix and mitochondrial inner membrane.

31. Topology The ontologies are structured as directed acyclic graphs, which are similar to hierarchies but differ in that a more specialized term (child) can be related to more than one less specialized term (parent). For example, the biological process term: hexose biosynthetic process has two parents, hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process. This is because biosynthetic process is a type of metabolic process and a hexose is a type of monosaccharide. When any gene involved in hexose biosynthetic process is annotated to this term, it is automatically annotated to both hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process.

32. ‘OMICS APPLICAZIONI MEDICHE Informazioni sulla malattia Farmacogenetica Test genetici Terapia genica

33. Farmacogenetica nella ricerca e sviluppo di nuovi farmaci Farmacogenetica: lo studio di variazioni genetiche e del loro effetto nella risposta a farmaci

34. Scoperta e sviluppo di nuovi farmaci

35. Studi genetici per la identificazione di nuovi bersagli terapeutici Inizi anni ‘80 si cercano polimorfismi associati alla manifestazione di Alzheimer Anni ‘90 ApoE appare associato a apparizione precoce di AD (60 anni negli omozigoti); In soggetti con ApoE2/3 la malattia generalmente appare dopo I 90 anni Dati confermati da genome-wide association studiesdove si studiano più di 500.000 SNP per volta

36. Traslocasi della membrana mitocondriale esterna A. Roses, NDD 2008

37. Studi genetici per lo studio dell’efficacia di un trattamento farmacologico

38. ROSIGLITAZONE IN PAZIENTI CON ALZHEIMER PORTATORI E NON DEL GENE APOE4

39. Studi genetici per l’ identificazione di pazienti a rischio di manifestare effetti collaterali specifici in seguito a trattamenti farmacologici

40. CYP2C9 e metabolismodiwarfarina • Pazienti con AIDS chesviluppanounasindromedaipersensibilità a trattamento con abacavir

42. Farmacovigilanza