Biotecnologie Farmacologiche Lezione 19-20 AA 2011-12

1. Biotecnologie Farmacologiche Lezione 19-20 AA 2011-12 Le proteine terapeutiche

2. Le proteine Più di 40.000 e moltissime funzioni OPPORTUNITA’ TERAPEUTICA

3. Cosa sono le proteine terapeutiche Proteine che sono state estratte da cellule umane o ingegnerizzate in laboratorio per essere utilizzate come farmaci Rimpiazzare la mancanza patologica di una proteina(enzimi, fattori del sangue) Rafforzare il sistema immunitario, contro cellule tumorali o infezioni(anticorpi monoclonali) Più di 250 in commercio, più di 400 in trial clinico

4. Quali sono vantaggi/svantaggi? VANTAGGI SVANTAGGI • Attività mirata e altamente specifica • Limitati effetti collaterali • Generalmente ben tollerate • Possono sopperire ad un difetto genetico • Veloce sviluppo clinico e approvazione FDA • Vantaggio finanziario: brevettabilità • Metodologie di produzione • Contaminanti nella purificazione • VIE DI SOMMINISTRAZIONE E FARMACOCINETICA

5. Sviluppo delle proteine terapeutiche • Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene umane • Proteine di II generazione modificate al fine di: • Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità, aumentare la penetrazione cellulare, ecc) • Generare prodotti inattivi con funzioni diverse da quelle originarie • Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione • Biosimilari

6. Produzione di proteine terapeutiche Proteine poco complesse • BATTERI • Ancora il più usato • Ottimizzazione • Problemi: recovery delle proteine  secretory signal peptide – mutazione del punto isoelettrico • Poche modificazioni post-traduzionali • PIANTE • Utilizzo in lenta crescita • Codice regolatorio per espressione • No modificazioni post-traduzionali • . Grandi volumi possibili Proteine complesse • CELLULE ANIMALI • Alti livelli di espressione e modificazioni • Costi elevatissimi per set-up e tempi lunghi per FDA approval • ANIMALI TRANSGENICI • Alti livelli di produzione • Espressione di proteine anche molto complesse • Costi bassi • Riproducibilità della produzione • Limite: approvazione regolatoria

7. Classificazione funzionale delle proteine terapeutiche Gruppo I Proteine con attività enzimatica o regolatoria Proteine con attività di targeting specifico Gruppo II Gruppo III Vaccini proteici Proteine diagnostiche Gruppo IV

8. Gruppo I Proteine con attività enzimatica o regolatoria

9. Rimpiazzare una proteina carente o non funzionale 1 Classiche proteine terapeutiche Utilizzate nel trattamento di malattie metaboliche o malattie genetiche che portano a carenza di una proteina

10. CLASSICO ESEMPIO: insulina nel trattamento del diabete Diabete: malattia caratterizzata da un alto e anormale tasso di zuccheri nel sangue, causato dalla carenza di insulina o resistenza alla sua azione Insulina: prima proteina terapeutica ricombinante ad entrare in commercio, nel 1982

11. Fattori di Coagulazione: altre proteine terapeutiche molto diffuse Emofilia: malattia genetica ereditaria che causa problemi nell’aggregazione piastrinica e nei processi di coagulazione Fattori di coagulazione: I fattori VIII e IX della coagulazione possono essere ripristinati negli emofilici

12. Nuovi trattamenti per malattie genetiche ereditarie Malattie come Gaucher, Fibrosi cistica, mucopolisaccaridosi, malattia di Fabry e altre malattie metaboliche genetiche Trattamento con enzimi e proteine che vanno a sopperire la carenza (es. enzimi pancreatici nella fibrosi cistica, beta-glucocerebrosidasi nella malattia di Gaucher)

13. Vantaggi delle tecniche del DNA ricombinante nella produzione di proteine terapeutiche di classe I Prima del DNA ricombinante Dopo il DNA ricombinante Insulina Dal 1922, purificata da pancreas bovini e porcini, e somministrata come iniezione in pazienti con diabete Dal 1982, prima proteina ricombinante commecializzata. Produzione efficiente e poco costosa. Problemi: - disponibilità di pancreas - costo della purificazione - reazioni immunologiche Beta-glucocere-brosidasi Possibili modificazioni (es, sostituz di un aa, che migliora le performance) Problemi: - disponibilità di placenta (50.000 placente/anno/paziente) Vantaggi connessi a minor costi, maggiore produzione, eliminazione rischio di malattie trasmissibili associate con la purificazione Inizialmente purificata dalla placenta umana

14. Rafforzare un pathway già esistente 2 Utilizzate per stimolare, aumentare, migliorare o allungare nel tempo un particolare meccanismo, anche se il meccanismo d’azione dettagliato non è noto

15. tPA (tissue plasminogen activator) ricombinante: L’infarto del miocardio: - Più comune causa di morte negli USA - dovuto ad occlusione di arterie coronarie causata dalla formazione di un trombo di una placca aterosclerotica. - Studi clinici hanno dimostrato che la lisi dei trombi con attivatori del plasminogeno diminuisce la mortalita’. Il tPA va ad ad agire nel processo di coagulazione

16. Il tPA agisce aumentando il processo fibrinolitico tPA prodotto dalle cellule endoteliali Plasmina (enzima fibrinolitico) Plasminogeno (proenzima)

17. Proteine terapeutiche di questo gruppo possono essere impiegate nella IVF IVF (in vitro fertilization): fertilizzazione della cellula uovo con lo spermatozoo in vitro. FSH (follicle-stimulating hormone): stimolo per oociti HCG (human chorionic gonadotropin): per promuovere la rottura del follicolo

18. Eritropoietina ricombinante Anemia e sindrome mieloplastica: presenti spesso nel caso di trattamenti chemoterapici che colpiscono le cellule del midollo osseo Eritropoietina: ormone secreto dai reni che stimola la produzione di eritrociti da parte del midollo osseo

19. Fornire una nuova funzione o attività 3 Proteine non umane presenti in natura sono utilizzate come trattamenti terapeutici per le patologie umane  uso razionale

20. Esempi dell’uso terapeutico di proteine esogene Papaina: proteina estratta dalla papaya usata per accelerare la riparazione delle ferite e la guarigione delle ustioni Irudina: proteina prodotte dalle ghiandole salivari delle sanguisughe (Hirudo medicinalis), ed è un potente inibitore della trombina (funzione anticoagulante)

21. PROTEINE TERAPEUTICHE DI SECONDA GENERAZIONE

22. PROTEINE TERAPEUTICHE DI II GENERAZIONE TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR: t-PA

23. L’INFARTO ACUTO AL MIOCARDIO E ’LA CAUSA PIU’ COMUNE DIMORTE NEGLI STATI UNITI • L’INFARTO E’ DOVUTO AD OCCLUSIONE DI ARTERIE CORONARIE CAUSATA DALLA FORMAZIONE DI UN TROMBO DI UNA PLACCA ATEROSCLEROTICA. • STUDI CLINICI HANNO DIMOSTRATO CHE LA LISI DEI TROMBI CON ATTIVATORI DEL PLASMINOGENO DIMINUISCE LA MORTALITA’. • FARMACI USATI PER AMI: • STREPTOCHINASI • ANISTREPLASI • UROCHINASI • T-PA placca lume

24. FARMACI TROMBOLITICI La terapia con farmaci trombolitici tende a dissolvere i trombi e i depositi di fibrina nei siti dove è avvenuto un danno vascolare. Ovviamente tutti questi farmaci sono altamente tossici perché provocano emorragie.

25. La deposizione di fibrina e piastrine a livello vascolare causa malattie tromboemboliche LA COAGULAZIONE

26. Cellule endoteliali trombo Il t-PA viene prodotto dalle cellule endoteliali e attiva il plasminogeno con taglio enziamatico t-PA Plasminogeno legato alla fibrina Plasmina legato alla fibrina Degradazione fibrina

27. STRUTTURA t-PA • SERIN PROTEASI • aa 527 (64kD) • 17 PONTI DISOLFURO • 4 N-GLICOSILAZIONI • 2 FORME (CON/SENZA GLICOSILAZIONE ASP184)

28. FINGER TAGLIO SERINPROTEASE KRINGLE Nel corso della fibrinolisi la FIBRINA depositata nel coagulo lega il t-PA e lo attiva Viene scisso legame Arg275-Ile276 • catena pesante N-terminale • responsabile del legame alla fibrina • DOMINIO FINGER • DOMINIO EGF-LIKE • DUE KRINGLE • catena leggera C-terminale responabile dell’attività catalitica • DOMINIO SERIN PROTEASI • His-Asp-Ser che taglia il plasminogeno

29. LIMITI DEL TRATTAMENTO INCAPACITA’ DI LISARE UNA SIGNIFICATIVA PROPORZIONE DI TROMBI CORONARICI COMPLICANZE EMORRAGICHE • NONOSTANTE L’IMPIEGO DEGLI AGENTI TROMBOLITICI ATTUALMENTE DISPONIBILI IL 45% DEI PAZIENTI NON PRESENTA DOPO 90’ UN RIPRISTINO COMPLETO DEL FLUSSO CORONARICO A CAUSA: • COMPLESSITA’ STRUTTURALE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA SU CUI SI FORMA IL TROMBO CORONARICO OCCLUDENTE • REGIME TERAPEUTICO

31. IDENTICO ALL’ENDOGENO t-PA UMANO EMIVITA < 5MIN PRODOTTO A UNA O DUE CATENE IN CHO ALTEPLASE SOMMINISTRAZIONE I.V. DOSE RACCOMANDATA: 0.9 mg/kg PER INFUSIONE DI 60’, IL 10% DI FARMACO DEVE ESSERE INIETTATO IN BOLO IN 1’ LA CLEARANCE EPATICA E’ RECETTORE MEDIATA: LE CELLULE DEL KUPPFER E ENDOTELIALI ATTRAVERSO IL RECETTORE DEL MANNOSIO, GLI EPATOCITI CON UN RECETTORE CARBOIDRATO INDIPENDENTE

32. RETEPLASE MUTANTE DI DELEZIONE (MANCA KRINGLE 1 , FINGER E EGFLIKE DOMAINS) NON GLICOSILATO AUMENTA L’EMIVITA (15 MIN) DIMINUISCE IL LEGAME CON LA FIBRINA SOMMINISTRATO IN DUE BOLI SEPARATI DA 30’ PRODOTTO IN E.COLI

33. TENECTEPLASE SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE IN DUE PUNTI DEL KRINGLE 1 AUMENTANO LA SPECIFICITA’ CON LA FIBRINA E DIMINUISCONO LA CLEARANCE PLASMATICA PROLUNGANDO L’EMIVITA (17 min) QUATTRO SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE NEL SITO CATALITICO AUMENTANO RESISTENZA AL PAI-1 E AUMENTANO LA SPECIFICITA’ CON LA FIBRINA GLY PER ASN 117 ASN PER THR A 103 ALA-ALA-ALA-ALA PER LYS-HIS-ARG-ARG A 296-299

34. LANOTEPLASE MUTANTE DI DELEZIONE DEL t-PA NATIVO (MANCA DEL FINGER E EGF LIKE DOMAIN)+MUTAZIONE PUNTIFORME DA ASN117 A GLN QUESTA MODIFICAZIONE EVITA LA CLEARANCE DA PARTE DEI REC PER IL MANNOSIO EPATICI PROLUNGANDO L’EMIVITA A 10’ PRODOTTO IN CHO

35. Residui aa che interagiscono con il recettore e importanti per la dimerizzazione: A1,A4,A5,A19,A21 B12,B16,B23,B24,B25,B26 l’inserzione di un aa carico promuove la repulsione fra monomeri (fast actinginsulinaspart) la conversione di HisB10 in Glu aumenta l’attività di 5 volte Residui aa che interagiscono con il recettore e importanti per la dimerizzazione: A1,A4,A5,A19,A21 B12,B16,B23,B24,B25,B26 l’inserzione di un aa carico promuove la repulsione fra monomeri (fast actinginsulinaspart) la conversione di HisB10 in Glu aumenta l’attività di 5 volte

36. INSULINA GLARGINA L’aumento del punto isoelettrico dell’insulina da 5.4 verso la neutralità (due arginine vengono aggiunte all’N-term. di B), causando la precipitazione nel sito d’iniezione, provoca un ritardo nell’assorbimento ed un prolungamento dell’effetto • INSULINA DETEMIR L’acilazione covalente della LysB29 promuove il legame reversibile dell’insulina all’albumina ritardandone la distribuzione e il trasporto transendoteliale

37. Proteine Terapeutiche di II generazione TNFa (Fattore di Necrosi Tumorale) una citochina che gioca un ruolo chiave nel danno infiammatorio in malattie autoimmuni o nella malattia di Crohn La prima di queste, l’ Etanercept (Enbrel), è una proteina di fusione dal peso molecolare di 150 kDa tra la forma solubile del recettore per il TNFalfa umano e la porzione Fc delle immunoglobuline umane IgG. Farmaci con funzione analoghe sono l’Infliximab (Remicade), un anticorpo monoclonale “chimerico” cioè in parte umano (frammento Fc umano) e in parte di derivazione murina (domini della catena variabile VK e VH) Adalimumab (HUMIRA) sviluppato molto recentemente che consta di un anticorpo interamente umanizzato.

38. AGGIUNTA DI POLIETILENGLICOLE (PEG) PER AUMENTARE LE DIMENSIONI DELLA PROTEINA E RIDURNE IL METABOLISMO E CLEARENCE RENALE

39. Analoghi del GH : Pegvisomant Analogo ricombinante di hGH - lys 120 sostituita con una gly previene la dimerizzazione funzionale del recettore qualsiasi aminoacido tranne lys o ala in questa posizione: Promotore della crescita Þ antagonista GH - Pegilazione – coniugazione via i gruppi aminici a 4 - 6 catene di polietilen-glicole Aumento di T1/2 (SC) a circa 6 giorni Picco plasmatico 33 - 77 ore Ridotta immunogenicità la pegilazione maschera i determinanti antigenici Ridotta affinità di legame altri otto aminoacidi sostituiti

40. Gruppo II Proteine con attività di targeting specifico

41. Interferire con una specifica molecola o meccanismo 1 Sfruttano la fine specificità di binding degli ANTICORPI MONOCLONALI; usate nel trattamento di patologie infiammatorie o tumori

42. Struttura degli anticorpi Parte di riconoscimento dell’antigene; nelle IMMUNOADESINE esso è sostituito con siti di binding a recettori di membrana Fc: fragmentcrystallizzable Riconosciuto dalle cellule del sistema immunitario  identifica le cellule che devono essere distrutte o eliminate

43. Tipi di anticorpi Murino Chimerico Umanizzato Umano Alta immunogenicità; Interazioni deboli con le proteine del complemento  poco efficiente; Bassa emivita. Dominio variabile murino e dominio costante umano; Riduce immunogenicità e aumenta emivita Con regione ipervariabile murina e restante umana (95%). A volte però meno efficaci Completamente umani, prodotto attraverso phage display o topi transgenici

44. Nomenclatura degli anticorpi (-mab) Es. ada-lim-u-mab Anticorpo contro TNFalfa tras-tu-zu-mab

45. Nelson et al., Nature Review Drug Discovery , 2010

46. Proteine di classe II che hanno TNFalfa come bersaglio – terapia immunogenica TNF-a: citochina implicata nei processi infiammatori sistemici; stimola le reazioni di fase acuta. La sua deregolazione è implicata in diverse patologie, inclusi alcuni tumori Immunoadesine Anticorpi monoclonali ETANERCEPT: Proteina di fusione tra TNFalpha receptor e regione Fc dell’IgG Lega l’eccesso di TNFa nel plasma, marcandolo per essere eliminato dal sistema immunitario. Terapia per artrite e psoriasi INFLIXIMAB - ADALIMUMAB: Anticorpi monoclonali contro TNFa Terapia per artrite reumatoide, Morbo di Crohn.

47. Proteine terapeutiche di classe II nella terapia oncologica Due meccanismi Aumento dell’immunogenicità Attivazione di pathways intracellulari RITUXIMAB: Lega la proteina transmembrana CD20 espressa sulle B-cells Il legame stimola la risposta immunitaria. Più del 90% delle B-cell dei linfomi non-Hodgkin’s esprime in maniera specifica CD20 terapia specifica. CETUXIMAB: Lega EGF receptor e stimola la risposta immuno-mediata. EGFR è espresso sulle cellule di alcuni tipi di tumori, come il carcinoma del colon-retto e tumore del collo TRASTUZUMAB: Lega il recettore HER2 sulle cellule tumorali della mammella. Sebbene contenga la Fc region che stimola la risposta immunitaria, la sua azione sembra indurre pathways di segnalazione intracellulare che portano al blocco della cdrescita e all’inibizione dell’angiogenesi RITUXIMAB MODIFICATO: Modificazioni nella Fc  stimolo dell’apoptosi

48. Proteine terapeutiche di classe II nella terapia di altre condizioni patologiche Nei trapianti d’organo: per ridurre i fenomeni di rigetto. Es. BASILIXIMAB, DACLIZUMAB: inibiscono l’attivazione dei linfociti IL-2 mediata poiché legano IL2 receptor Nelle infezioni da HIV: Es. ENFUVRITIDE: immunoadesina costituita da un peptide di 36 aa che inibisce l’entrata di HIV nella cellula ospite + riconoscimento per gp120 (proteina dell’envelope di HIV) Nel trattamento di asma irresponsiva a normali trattamenti: Es. OMALIZUMAB: lega il recettore si mastociti e basofili nei polmoni, riducendo il rilascio di mediatori infiammatori

49. Delivery di altri composti o proteine al sito target 2 Sfruttano la fine specificità di binding degli ANTICORPI MONOCLONALI per fare delivery di altri composto, sostanze, medicinali. Area in grande sviluppo

50. Tipologie di anticorpi di delivery Cellula tumorale