BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 7 Proteine terapeutiche

1. CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 7 Proteine terapeutiche

2. Biotechnology Industry Organization (BIO) Proteine terapeutiche • Il numero di proteine terapeutiche attualmente in commercio supera i 250. • I farmaci biotecnologici che vengono utilizzati per 384 indicazioni di cui 200 sono nuove terapie • Attualmente ci sono più di 400 prodotti terapeutici biotecnologici in trial clinici. I farmaci in studio sono per la terapia di diversi tipi di neoplasie, Alzheimer, malattie cardiovascolari, diabete, sclerosi multipla, AIDS e artrite.

3. Proteine terapeutiche • Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene umane • Proteine di II generazione modificate al fine di: • Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità, aumentare la penetrazione cellulare, ecc) • Generare prodotti innvativi con funzioni diverse da quelle originarie • Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione • Biosimilari

4. Proteine terapeutiche - Svantaggi • nuove metodologie di produzione • riproducibilità nella produzione • purificazione della macromolecola di sintesi • contaminanti nella purificazione • stabilità del prodotto finito • vie di somministrazione e farmacocinetica

5. Proteine terapeutiche – Vantaggi Generalmente esercitano una attività estremamente mirata e specifica Data la loro specificità hanno limitati effetti collaterali indesiderati Data la loro alta specificità ed essendo di origine umana sono generalmente ben tollerati Possono sopperire a un difetto genetico – nuovi bersagli terapeutici Il tempo di approvazione da parte delle autorità regolatorie è significativamente inferiore a quello di molecole di sintesi (1 anno per 33 proteine/ 294 piccole molecole approvate tra 1980 e 2002 ) La protezione brevettuale può essere più lunga di altri composti per le difficoltà di ottenere prodotti biosimilari

6. RICERCA PRECLINICA E FARMACI BIOTEC DRUG DISCOVERY: - scelta del bersaglio biologico - scelta dell’origine della molecola a potenziale attivita’ farmacologica (lead compound) - identificazione della molecola attiva sul bersaglio mediante opportuno screening FORMULAZIONE FARMACEUTICA FARMACOCINETICA E METABOLISMO FARMACOLOGIA GENERALE TOSSICOLOGIA FORMULAZIONE DEL DOSSIER PER INIZIO SPERIMENTAZIONE CLINICA

7. Farmaci biotecnologici A fronte di un mercato farmaceutico in crescita del 7% rispetto al 2006, il mercato dei farmaci biotecnologici è cresciuto del 17.9% e oggi è pari a 65 miliardi di dollari (circa il 10% del mercato dei farmaci globale), inoltre due prodotti Biotech, Aranesp e Enbrel, sono state tra i primi dieci farmaci più venduti nel mondo nel 2006.

8. INSULINA

9. INSULINA ormone polipeptico prodotto dalle cellule b del pancreas

10. SINTESI E MATURAZIONE DELL’INSULINA PREPROINSULINA RETICOLO ENDOPLASMATICO peptide segnale PROINSULINA GRANULI DI SECREZIONE DEL GOLGI peptide C catena A (21aa) catena B (30aa) aa 51

11. PRODUZIONE DI INSULINA 1921-Scoperta dell’insulina (Banting e Best) e sua produzione per estrazione dal pancreas bovino o porcino PANCREAS DI MAIALE ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE

12. PRODUZIONE DI INSULINA • 1921- 1980: • Aumento stabilità chimica delle preparazioni di insulina con Zn++ e con formulazioni neutre (in ambiente acido avvengono reazioni di deamidazione) • Ottimizzazione tecniche estrattive e di purificazione (cromatografie) DIMERI DI INSULINA Zn++ Zn++ ESAMERO DI INSULINA

13. PRODUZIONE DI INSULINA catena B Conversione enzimatica insulina SUINA in UMANA Digestione con tripsina pH7.5 Gly23 e Arg22 SEFADEX da 10g di insulina suina ne vengono prodotti 7 di umana Octapeptide C-terminale insulina umana sintetizzato chimicamente Prodotto di digestione +

14. PRODUZIONE DI INSULINA 1982 DNA RICOMBINANTE VANTAGGI PLASMIDE D’ESPRESSIONE GENE INSULINA UMANA E.COLI REAZIONI IMMUNITARIE ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE ELIMINAZIONE USO ANIMALI

15. PRODUZIONE DI INSULINA GENENTECH: produzione in E.Coli di catene A e B separate e poi incubate in ambiente ossidativo per formare i ponti disolfuro E.COLI B A

16. PRODUZIONE DI INSULINA ELYLILLY FERMENTAZIONE INSULINA ALTAMENTE PURIFICATA recupero delle cellule RP-HPLC INSULINA PURIFICATA PROINSULINA CRUDA colonne di scambio ionico cristallizzazione gel filtrazione proteolisi enzimatica PROINSULINA PARZIALMENTE PURIFICATA INSULINA CRUDA

17. MODIFICAZIONI DELL’ INSULINA Residui aa che interagiscono con il recettore e importanti per la dimerizzazione: A1,A4,A5,A19,A21 B12,B16,B23,B24,B25,B26 l’inserzione di un aa carico promuove la repulsione fra monomeri (fast acting insulin aspart) la conversione di HisB10 in Glu aumenta l’attività di 5 volte

18. STRATEGIE INNOVATIVE DELL’INSULINA • INSULINA GLARGINA L’aumento del punto isoelettrico dell’insulina da 5.4 verso la neutralità (due arginine vengono aggiunte all’N-term. di B), causando la precipitazione nel sito d’iniezione, provoca un ritardo nell’assorbimento ed un prolungamento dell’effetto • INSULINA DETEMIR L’acilazione covalente della LysB29 promuove il legame reversibile dell’insulina all’albumina ritardandone la distribuzione e il trasporto transendoteliale

19. TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR: t-PA

20. L’INFARTO ACUTO AL MIOCARDIO (AMI) E ’LA PIU’ COMUNE CAUSA DI MORTE NEGLI STATI UNITI • Di solito l’infarto e’ dovuto ad occlusione di arterie coronarie causata dalla formazione di un trombo di una placca aterosclerotica. • Studi clinici hanno dimostrato che la lisi dei trombi con attivatori del plasminogeno diminuisce la mortalita’. • FARMACI USATI PER AMI: • STREPTOCHINASI • ANISTREPLASI • UROCHINASI • T-PA placca lume

21. FARMACI TROMBOLITICI La terapia con farmaci trombolitici tende a dissolvere i trombi e i depositi di fibrina nei siti dove è avvenuto un danno vascolare. Ovviamente tutti questi farmaci sono altamente tossici perché provocano emorragie.

22. LIMITI DEL TRATTAMENTO COMPLICANZE EMORRAGICHE INCAPACITA’ DI LISARE UNA SIGNIFICATIVA PROPORZIONE DI TROMBI CORONARICI • NONOSTANTE L’IMPIEGO DEGLI AGENTI TROMBOLITICI ATTUALMENTE DISPONIBILI IL 45% DEI PAZIENTI NON PRESENTA DOPO 90’ UN RIPRISTINO COMPLETO DEL FLUSSO CORONARICO A CAUSA: • COMPLESSITA’ STRUTTURALE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA SU CUI SI FORMA IL TROMBO CORONARICO OCCLUDENTE • REGIME TERAPEUTICO

23. LA COAGULAZIONE

24. LA FIBRINOLISI t-PA PAI-1 E PAI-2 PLASMINA (enzima fibrinolitico) PLASMINOGENO (proenzima) a2-ANTIPLASMINA FIBRINA PRODOTTI DEGRADATI

25. Cellule endoteliali trombo Il t-PA viene prodotto dalle cellule endoteliali e attiva il plasminogeno con taglio enzimatico all’Arg560 t-PA Plasminogeno legato alla fibrina Plasmina legata alla fibrina Degradazione fibrina

26. STRUTTURA t-PA • SERIN PROTEASI • aa 527 (64kD) • 17 PONTI DISOLFURO • 4 N-GLICOSILAZIONI • 2 FORME (CON/SENZA GLICOSILAZIONE ASP184)

27. FINGER TAGLIO SERINPROTEASE KRINGLE Nel corso della fibrinolisi la FIBRINA depositata nel coagulo lega il t-PA e lo attiva Viene scisso legame Arg275-Ile276 • catena pesante N-terminale • responsabile del legame alla fibrina • DOMINIO FINGER • DOMINIO EGF-LIKE • DUE KRINGLE • catena leggera C-terminale responabile dell’attività catalitica • DOMINIO SERIN PROTEASI • His-Asp-Ser che taglia il plasminogeno

28. PRODOTTI COMMERCIALIZZATI

29. EMIVITA <5MIN PRODOTTO A UNA O DUE CATENE IN CHO IDENTICO ALL’ENDOGENO t-PA UMANO ALTEPLASE SOMMINISTRAZIONE I.V. DOSE RACCOMANDATA: 0.9 mg/kg PER INFUSIONE DI 60’, IL 10% DI FARMACO DEVE ESSERE INIETTATO IN BOLO IN 1’ LA CLEARANCE EPATICA E’ RECETTORE MEDIATA: LE CELLULE DEL KUPPFER E ENDOTELIALI ATTRAVERSO IL RECETTORE DEL MANNOSIO, GLI EPATOCITI CON UN RECETTORE CARBOIDRATO INDIPENDENTE

30. RETEPLASE (2a generazione) MUTANTE DI DELEZIONE (MANCA KRINGLE 1 , FINGER E EGFLIKE DOMAINS) NON GLICOSILATO AUMENTA L’EMIVITA (15 MIN) DIMINUISCE IL LEGAME CON LA FIBRINA PRODOTTO IN E.COLI

31. TENECTEPLASE SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE IN DUE PUNTI DEL KRINGLE 1 AUMENTANO LA SPECIFICITA’ CON LA FIBRINA E DIMINUISCONO LA CLEARANCE PLASMATICA PROLUNGANDO L’EMIVITA (17 min) QUATTRO SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE NEL SITO CATALITICO AUMENTANO RESISTENZA AL PAI-1 E AUMENTANO LA SPECIFICITA’ CON LA FIBRINA GLY PER ASN 117 ASN PER THR A 103 ALA-ALA-ALA-ALA PER LYS-HIS-ARG-ARG A 296-299

32. NUOVE PROSPETTIVE: LANOTEPLASE MUTANTE DI DELEZIONE DEL t-PA NATIVO (MANCA DEL FINGER E EGF LIKE DOMAIN)+MUTAZIONE PUNTIFORME DA ASN117 A GLN QUESTA MODIFICAZIONE EVITA LA CLEARANCE DA PARTE DEI REC PER IL MANNOSIO EPATICI PROLUNGANDO L’EMIVITA A 10’ PRODOTTO IN CHO

33. Proteine terapeutiche di I e II generazione: una nuova classificazione funzionale Leader et al. Nature ReviewsDrugDiscovery 7: 21-35, 2008

34. PROTEINE TERAPEUTICHE –classificazione funzionale Gruppo I: proteine terapeutiche con attività enzimatica o regolatoria 1a che rimpiazzano una proteina deficiente o anormale 1b che aumentano attività esistenti 1c che danno nuove funzioni/attività Gruppo II: proteine terapeutiche con bersagli mirati 2a che interferiscono con l’attività fisio-patologiche 2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico Gruppo III: vaccini proteici 3a che proteggono nei confronti di microorganismi esterni 3b per il trattamento di malattie autoimmuni 3c per la terapia anti-neoplastica Gruppo IV proteine con attività diagnostica

35. Gruppo I proteine terapeutiche con attività enzimatica o regolatoria 1a che rimpiazzano una proteina deficiente o anormale 1b che aumentano attività esistenti 1c che danno nuove funzioni/attività

39. Gruppo II proteine terapeutiche con bersagli mirati 2a che interferiscono con l’attività fisio- patologiche 2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico

41. Riconoscimento antigene Riconoscimento antigene Stabilità Regione cerniera Reclutamento di funzioni effettrici Frammento Fc Legame al recettore di riciclo STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999

42. LE IMMUNOGLOBULINE SONO NATURALMENTE SUDDIVISE IN DOMINI FUNZIONALI Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999

43. PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON ANTICORPI 1975 George Kohler and Cesar Milstein (Nobel 1984) sviluppano la tecnologia di ibridazione somatica per la produzione di anticorpi monoclonali Anticorpi Monoclonali MURINI in vivo: • PRINCIPALI VANTAGGI: • OMOGENEITA’ DELLE PREPARAZIONI • SEMPLICITA’ DI PREPARAZIONE

44. Murino Chimerico Umanizzato Umano

45. Cellula ES Inserimento dei geni esogeni Inattivazione dei geni endogeni IgH murina IgH umana Igk umana Igk murina X X Fusione sferoplasti contenenti cloni YAC Linea trasgenica producente anticorpi murini e umani Linea trasgenica incapace di produrre anticorpi murini Linea trasgenica producente anticorpi umani A B C

47. Rituximab Il rituximab si lega a CD20, che si trova sulla superficie di uno dei tipi principali di globuli bianchi normali (linfociti B). Questa proteina si trova anche sulla superficie della maggior parte dei linfociti B che causano alcune forme di linfoma non Hodgkin. Il rituximab agisce attaccando sia i linfociti B maligni sia quelli normali; tuttavia, l’organismo è in grado di sostituire rapidamente eventuali globuli bianchi normali danneggiati, riducendo in tal modo sensibilmente il rischio di effetti collaterali. Quando l’anticorpo monoclonale riconosce la proteina, LA LEGA e in questo modo stimola il sistema immunitario dell’organismo ad aggredire le cellule neoplastiche e può anche indurre le cellule a distruggere se stesse.

48. Rituximab: alcuni dati!! • Primo anticorpo per terapia oncologica • Il trattamento con rituximab da solo o in combinazione con chemioterapia e’ in grado di dare una significativa risposta clinica (40% vs 10% ) ed un significativo prolungamento di tempo alla ricaduta (27 mesi vs 7 mesi) • > 350.000 pazienti trattati • >80 trial clinici in corso (www.clinical trials.gov)

50. HER2/EGFR Transtuzumab e Cetuximab meccanismo d’azione Blocco del segnale di crescita Altri meccanismi immunologici