Déterminisme du Sexe et la compensation de dose chez la souris

1. Déterminisme du Sexe et la compensation de dose chez la souris

2. Gametogenèse, compensation de dose, empreintes génomiques, souris mutantes-t,déterminisme de sexe

4. Le sexe est déterminé par le gonade XX:développement des ovairessystème Mullerianorganes génitaux femelle XY:développement des testiculesSystème Wolffianorganes génitaux mâle Enlève les gonades avant que le sexe soit déterminé: -chez les souris XX et XY développement du système Mullerian Greffe d’un testicule à coté d’une ovaire à 12 jours: -Wolffian développe et le Mullerian disparaît. Donc: L’ovaire n’est pas essentiel pour le développement du système Mullerian -Le testicule est essentiel pour le développement du Système Wolffian -Le testicule produit une molécule qui inhibe le développement du système Mullerian

5. Développement mâle et femelle

7. Zfy et Sxr • A Oxford en 1971 ils ont trouvé une souris sex-reversed: Sxr • XX mais mâle à cause d’une translocation • Cherchez dans cette région pour le gène commutateur • Page et al: ont trouvé un gène Zfy • -zinc finger facteur de transcription • Par Southern blot ils ont détecté deux bandes: une séquence sur le chromosome X et l’autre sur le chromosome Y???? • 3 explications: • -allèles X et Y sont des sous-unités d’une protéine • -allèle X est non fonctionnel • -inactivation du chromosome X chez la femelle donne un seul allèle actif chez le femelle, deux chez la mâle • BUT: Zfy n’est pas exprimé dans les testicules des souris Steel…donc c’est pas le bon candidat.

9. Quels sont les cibles de Sry • Sry se fixent sur une séquence de 6/7 nucléotides ( AACAAT oligonucléotide sélection). • Cherchez des gènes qui s’expriment après Sry et où la séquence de 6/7 nucléotides est présente dans le promoteur. • Sox 9 ( 20 gènes Sox chez la souris: important pendant le développement: SrybOX) • Souris transgènique: Sry promoteur+myc. Regarde l’expression de la protéine MYC et l’expression de la protéine SOX9. • MYC ensuite MYC+SOX9 ensuite SOX9 • Conclusion: Sry gène est transcrit pour une période courte et la protéine SRY active le promoteur du gène SOX9. • SOX9 peut changer le sexe d’une souris. • SRY peut probablement activer le gène AMH ( anti-Mullerian hormone)  dégénération des structures femelles • Sox3: inhibiteur du gène Sox9???

10. Expression de la protéine SRY

11. Régulation de l’expression du gène SryWT1=Wilms Tumour Gene: +/- KTS ( +/- lysine threonine serine dans un des doigts à zinc qui se fixe sur l’ADN)

12. Sry/SRY murine et humainPeu de conservation en dehors de la boîte HMGMurine protéine tronquée ne fonctionne plusProtéine humaine fonctionne chez la sourisL’activité de SRY dépend de son état de phosphorylation?

13. Un gène pour le développement femelle? • La majorité des XY femelles n’ont pas de mutation dans le gène Sry. • La duplication d’un gène sur le chromosome X-Dax1-peut donner des XY femelles • Dax-1 s’exprime dans les même cellules que Sry, au même moment mais l’expression continue après • Sur-exprime Dax-1 chez M.musculus musculus: pas d’effet • Sur-exprime chez M.musculus poschiavinus ( allèle faible de Sry) faible changement dans les gonades. • Plus probable que le rôle de Dax-1 est d’empêcher le développement mâle chez la femelle • intéraction avec SF1, molécule essentiel pour le développement mâle.

14. Rôle de Sox3 ? • >100 XX mâle où Sry ne s’exprime pas • Beaucoup plus probable qu’il s’agit d’une inhibiteur de l’expression de Sry qui est muté qu’un gain-of function. • Modèle: • SOX9 est essentiel pour devenir mâle • SOX3 peut inhiber Sox9femelle • SRY peut inhiber Sox3 • Donc SRY et SOX3 sont des inhibiteurs et pas des activateurs?

15. L’expression de Sry dans le cerveau • Testosterone est central pour le développement du comportement mâle • SRY est produite dans les même cellules qui produisent tyrosine hydroxylasesynthèse de dopamine • Anti-sens oligonucléotides inhibition de SRY empêche la fonction des cellules essentielles dans les fonctions moteurs chez le rat • Chez la femelle les oestrogens peuvent assurer la fonction de SRY • De plus….. • Sry peut agir comme facteur d’épissage • Les transcrits de Sry sont parfois circulaire et non-fonctionnels

16. Role du gène Foxl2 • Mutations dans ce gène empêche le développement de l’ovaire et sont associées avec XX sex-reversal • Absence de l’expression de Foxl2 change le développement de 2 linéages: • Les granulosa cells Sertoli like • Les theca cells ( synthèse des steroids) synthetisent le précurseur de la testosterone • Rôle de Foxl2: réprime l’expression de Sox9 dans l’ovaire • Foxl2 fonctionne avec le récepteur de l’oestrogen ( ce qui explique en partie le sex reversal associé avec des problèmes des hormones)

17. L’activation de Sox9 est inhibe par l’expression de FOXL2a) TESCO ( Testis specific enhancer of Sox9) active un gène rapporteur dans le testis mais pas dans l’ovairec) Par ChiP FOXL2 peut se fixer sur la séquence TESCOd) FOXL2 peut reprimer l’expression d’un gène rapporteur sous le contrôle de TESCO

18. DMRT1Double-sex and Mab3-related transcription factor 1 • The only molecular similarity in sex determination found so far among phyla is between the Drosophila doublesex (dsx) and Caenorhabditis elegans mab-3 genes. dsx and mab-3 contain a zinc finger-like DNA-binding motif called the DM domain, perform several related regulatory functions, and are at least partially interchangeable in vivo. A DM domain gene called Dmrt1 has been implicated in male gonad development in a variety of vertebrates, on the basis of embryonic expression and chromosomal location. Such evidence is highly suggestive of a conserved role(s) for Dmrt1 in vertebrate sexual development, but there has been no functional analysis of this gene in any species. Here we show that murine Dmrt1 is essential for postnatal testis differentiation, with mutant phenotypes similar to those caused by human chromosome 9p deletions that remove the gene. As in the case of 9p deletions, Dmrt1 is dispensable for ovary development in the mouse. Thus, as in invertebrates, a DM domain gene regulates vertebrate male development.

19. SrySox9Sertoli cellstesticulemâleGranulosa cellsovairefemelleChez le mâle ainsi que chez la femelle la différentiation des cellules de Sertoli et les Granulosa cells est reversible.Des souris DMRT1 Ko conditionnelles:Dhh-cre ( Sertoli cells)Sf1-cre (Sertoli cells)Nanos-cre ( cellules germinales)Regarder l’expression de FoxL2 et Sox9

21. a) Expression des gènes chez les souris normales(blanc) et les souris KO de DMRT1(noir)b) qChip avec des anti-corps anti-DMRT1c) modèle. • a

22. DMRT-1 chez la souris et chez l’hommeDélétion du gène Dmrt-1 (chromosome 9p)XY sex reversal ( à la naissance le bébé XY est femelle)Délétion chez la sourisà la naissance des souris XY sont mâles et le sex reversal se fait pendant les premières semaines après la naissancePourquoi? Période de gestation plus long chez l’homme, redondance du gène Dmrt-1 chez la souris?

23. Tortoiseshell cat/ Ecaille de tortue

24. X-linked diseases a

25. L’expression des gènes sur le chromosome X et Y chez des mâles et les femelles dans 6 tissus différents

26. L’inactivation du chromosome X pendant la vie d’une souris a

27. L’inactivation aléatoire du chromosome X chez la femelleL’embryon a reçu un allèle normal et un allèle mutant de ses parents. Dans le cas où la mutation désavantage les cellules, ces cellules peuvent être éliminé et donc le résultat de l’inactivation est biaisé.

28. Le gène Xist Xic ( X Inactivation Center ) identifié par les translocations Cherchez un gène dans cette région qui s’exprime uniquement à partir du chromosome X inactif Xist: X Inactive chromosome Specific Transcript: 17kb, pas de cadre ouverte de lecture, toujours dans le noyau, jamais dans les polyribosomes Pas d’expression chez les mâles Présent dans plusieurs espèces différents

30. Conservation des séquences dans les gènes Xist: les A repeats (1) sont le plus conservées ainsi que la région 4. Les transcrits Xist sans les A repeats ne fonctionnent plus ( les transcrits sont localisés sur le chromosome en cis mais sans inactiver). H=human M=mouse R,A,T,K= 4 compagnoles (voles)

31. La région Xic: a) 5 ARN non-codantes sont détectés:b) Xist s’exprime au début à partir des 2 X chez les cellules femelles et ensuite un des deux X montre une forte expressionc) Rnf12-ubiquitin ligase: détruit un répresseur de l’expression de Xist?

32. Le gène Tsix • Délétion de 65kb dans le région 3’ du Xist . • Le chromosome X avec cette délétion est toujours inactivé • Dans cette région on trouve la région 5’ d’un gène Tsix transcrit dans l’autre sens de Xist • Xist------------------------------ • -------------------------------------------------------------------------- Chr X • -----------------------------------Tsix • -------------------Xic-----------------------------

33. Plusieurs allèles de Xic • Les allèles plus ou moins forts de Xic existe: a<b<c<d • Dans une souris Xic a/Xic c: X avec l’allèle a est 80% du temps inactivé: c’est plus aléatoire • La dominance des allèles est associé avec le niveau de transcription en amont du début de transcription de Tsix: 6kb région identifié • a (allèle faible) montre une transcription moins important que l’allèle c • Introduit les mutations dans cette région--- des transcripts tronqués: pas d’effet sur la dominance. • Un enhancer?? Stockage des facteurs de transcription?

35. Histone Code

36. Modifications des histones du gène Xist

37. Xist inactivation complèxe

38. Etapes moléculaires pendant l’inactivation du chromosome X

40. Counting ChromosomesBlocking factor produit par les autosomesun chromosome X est protégé contre l’inactivation Competence Factor produit par les chromosomes X et il faut deux doses pour inactiver

41. Counting chromosomes….la suite • Tel---------------------------------------------------------------------------Cen • Xist---------- • ------------------Tsix • -------- Délétion 5’Tsix (a) • --------/------/------ Tr 5’Tsix (b) • Souris a) toujours le X avec la délétion inactivé: site du blocking factor • Souris b) Si cette région contient le site pour le blocking factor, ce transgène devrait éponger le factor--X-inactivation chez le male. On ne voit pas cela. On ne trouve pas les transcrits du gène Xist sur le transgène ou le chromosome X. • Souris a) homozygous: la moitié des cellules meurent: les cellules inactivent soit un, soit deux chromosomes X. Chaotique.

42. Les étapes principaux pendant l’inactivation du chromosome X

43. Les facteurs impliqués dans la régulation de l’expression de Xist/Tsix. Les molécules en bleus sont soit des activateurs soit des inhibiteurs de Xist ou de Tsix. Les lignes bleus sont des ARN non-codants qui sont probablement importants dans la régulation. Tim Pollex , Edith Heard Recent advances in X-chromosome inactivation research Current Opinion in Cell Biology Volume 24, Issue 6 2012 825 - 832 http://dx.doi.org/10.1016/j.ceb.2012.10.007

44. Stade précoce de la différentiation: Oct 4,Sox2 et Nanog réprimésactivation de Rnf12ubiquitinilyation Rex1Oct4,Sox2 et Nanog réprimésXist n’est plus réprimésc-myc/Klf4 réprimésTsix peut être répriméJpx/Ftx activent Xist

45. Sha Sun , Brian C. Del Rosario , Attila Szanto , Yuya Ogawa , Yesu Jeon , Jeannie T. Lee Jpx RNA Activates Xist by Evicting CTCF Cell Volume 153, Issue 7 2013 1537 - 1551 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.028

46. Les transcrits du gène Xist sont essentiels pour l’inactivation: c’est pas juste l’activation du promoteur et une changement dans la chromatine. 2000 transcrits Xist par cellule: pas suffisant pour couvrir tout le chromosome. Le chromosome X est riche en séquences LINE ( Long Interspersed Nuclear Elements). Présent aussi sur les autres chromosomes. Les transcrits Xist se fixent sur les séquences LINE: un complexe se forme qui change la conformation du chromosome dans un région autour de ce complexe Les séquences LINE

47. Un architecture différent de la chromatin sur les chromosomes X actif et inactif: des intéractions en cis et trans sont beaucoup plus nombreuses sur la chromatine du X actif. 4C: circular chromosome conformation capture Current Opinion in Cell Biology Volume 24, Issue 6 2012 825 - 832 http://dx.doi.org/10.1016/j.ceb.2012.10.007

48. L’inactivation du chromosome X pendant le développement de la souris

49. Gènes qui échappent à l’inactivation chez l’Homme:Beaucoup moins échappent chez la souris: pas de centromère?Les gènes qui échappent chez l’homme ont peut être une fonction spécifique aux femmes?Certains gènes peuvent être inactivé et ensuite réactivéXO chez l’homme et chez la souris?

50. X-Escapées • 15% des gènes sur le X échappent chez l’homme • 3% échappent chez la souris • Les gènes qui échappent ont une expression souvent moins important que la copie sur le X actif • Chez l’homme les éscapées sont dans les blocs • Chez la souris ils sont isolés et dans la chromatine silencieux • Chez l’homme les gènes qui échappent sont variables selon l’individuel et selon le tissu • Les gènes qui échappent peuvent être inactivé plus tard