1 / 55

Kinetika

Kinetika. Mihaelis-Menten-ova jedna čina. Mihaelis-Menten-ov mehanizam. Enzim-supstrat kompleks je u ravnoteži sa slobodnim enzimom i supstratom ES kompleks – Mihaelisov kompleks Ks – konstanta disocijacije ES kompleksa Korak koji odredjuje brzinu reakcije je raspad kompleksa ES na E i P.

yanisin-vargas
Télécharger la présentation

Kinetika

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Kinetika

  2. Mihaelis-Menten-ova jednačina

  3. Mihaelis-Menten-ov mehanizam Enzim-supstrat kompleks je u ravnoteži sa slobodnim enzimom i supstratom ES kompleks – Mihaelisov kompleks Ks – konstanta disocijacije ES kompleksa Korak koji odredjuje brzinu reakcije je raspad kompleksa ES na E i P

  4. Brigs-Haldan-ov mehanizam Uvode pojam ravnotežnog stanja: ukoliko je brzina reakcije konstantna u odredjenom vremenskom intervalu, i koncentracija ES je takodje konstantna Km = (k2 + k-1)k1 Ks = k-1/k1 Km = Ks + k2/k1

  5. Linearni oblici Mihaelis-Menten-ove jednačine Lineweaver-Burk Hanes Eadie-Hofstee Distribucija greške za različite metode linearizacije

  6. Km: 10-1 – 10-7 M

  7. Konstanta specifičnosti

  8. Mehanizam sa intermedijerima

  9. kcat je konstanta prvog reda koja se odnosti na osobine i reakcije ES, E-intermedijer i EP • Km: prividna konstanta disocijacije koja se moze smatrati opštom konstantom • disocijacije za sve komplekse koje gradi E • Značenje kcat/Km: konstanta specifičnosti; odnosi se na svojstva i reakcije • slobodnog enzima i slobodnog supstrata

  10. Prolazna vremena vs. konstante brzine Enzimske reakcije koje uključuju više intermedijera! (Himotripsin) Briggs-Haldan-ov mehanizam Prolazna vremena su aditivna.

  11. Integralni oblik MM jednačine Krive progresa reakcije (jedna konc. S više merenja)

  12. Enzim mora da bude stabilan tokom čitavog merenja • Povratna reakcija mora da bude zanimarljiva • Proizvod ne sme da inhibira enzim

  13. Kompetujući supstrati

  14. Specifičnost prema kompetujućim supstratima

  15. Haldanova jednačina Da li ravnoteža u reverzibilnim enzimima katalizovanim reakcijama zavisi od prisustva enzima?

  16. Ravnoteža na površini enzima Ravnotežne konstante na površini enzima su drugačije od konstanti u rastvoru. Razlozi: 1. napon; 2. neproduktivno vezivanje; 3. entropijski faktor

  17. Inhibicije • Izučavanje složenih metaboličkih puteva • Izučavanje složenih multisupstratnih reakcija • Enzimske inaktivacije i zdravlje (trovanje i lekovi) • Tipovi inhibicije: • reverzibilna (kompletna i parcijalna) i • ireverzibilna (inaktivacija) • Tipovi reverzibilne inhibicije: • Kompetitivna • Antikompetitivna • Mešovita • Nekompetativna

  18. Kompetitivna inhibicija Inhibitor (I) i supstrat se vezuju za isto mesto na enzimu Jednostavni MM mehanizam Km se menja, ali ne i Vmax

  19. Linearizovani oblici MM jednačine za kompetitivnu inhibiciju

  20. Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju kompetitivne inhibicije LB metodom

  21. Akompetitivni tip inhibicije • Inhibitor se vezuje za kompleks ES, ali ne i za slobodan enzim • Uspostavlja se ravnotežno stanje, pri čemu je kompleks ESI u ravnoteži sa ES

  22. Linearizovani oblici MM jednačine za ampetitivnu inhibiciju

  23. Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju akompetitivne inhibicije LB metodom

  24. Mešovita inhibicija (specijalni slučaj – nekompetitivna inhibicija)

  25. Linearizovani oblici MM jednačine za mešovitu inhibiciju

  26. Sekundarni grafici za određivanje Ki i Ki’ u slučaju mešovite inhibicije LB metodom

  27. Nekompetitivna inhibicija *Inhibitor utiče samo na katalitičku funkciju enzima, ali ne i na vezivanje supstrata *Važan tip inhibicije za multisupstratne enzime *Pri niskim koncentracijama S, efekat inhibitora se može zanemariti

  28. Linearizovani oblici MM jednačine za nekompetitivnu inhibiciju

  29. Sekundarni grafici za određivanje Ki i u slučaju nekompetitivne inhibicije LB metodom

  30. Efekti različitih inhibitora na parametre u MM jednačini Km app. Km aKm Km/a’ * aKm/a’ *Specijalan slučaj: a = a’, nekompetitivna inhibicija, Km se ne menja, Vmax se smanjuje za faktor a’

  31. Odstupanje od MM jednačine Inhibicija (aktivacija) supstratom

  32. Neproduktivno vezivanje Km i kcat se smanjuju Km je manje od Ks Važi i za reakcione mehanizme u kojima nastaju intermedijeri!

  33. `=

  34. Praktični aspekti određivanja u enzimologiji • Odredjivanja enzimskih aktivnosti • Optimalni uslovi • Prisustvo supstrata • Prisustvo kofaktora • Kinetička odredjivanja • Kinetički parametri

  35. Enzimska aktivnost (IU ili U, Katal) • Specifična aktivnost (U/mg) • Koncentracija enzimske aktivnosti U/mL • Turnover number, molekulska aktivnost (1/min, 1/s) • Aktivnost katalitičkog centra (kcat)

  36. Prečišćavanje enzima -         Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti -         Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina -         Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena -         Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapremina, conc., akt.) -         Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoći Neke osnovne definicije: • Jedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri standardnim uslovima*. • 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 s Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti.Specifična aktivnost ovog rastvora će biti 100 U/mg proteina. *Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće: -         Temperatura 30 oC -         pH optimum za dati sistem Enz-Sub Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km)

More Related