AISLAMIENTO DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE POLIHIDROXIALCANOATOS MEDIANTE UNA COMBINACIÓN DE ENFOQUES FENOTÍPICOS Y GENOTÍP

1. AISLAMIENTO DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE POLIHIDROXIALCANOATOS MEDIANTE UNA COMBINACIÓN DE ENFOQUES FENOTÍPICOS Y GENOTÍPICOS S.–S. Si, Y.–C. Chuang, C.-H. Chen CURSO: BIOTECNOLOGÍA DOCENTE: Dr. HEBERT HERNAN SOTO GONZALES ALUMNA: ADRIANA KHRISTAL VIGLANZONI MENDOZA

2. Los polihidroxialcanoatos (PHA), son un grupo de poliésteres sintetizados por bacterias, arqueas y algunos hongos, cuando el sustrato de carbono es superior a otros nutrientes como el N, S, P y O, muchos microorganismos pueden acumular PHA como energía intracelular y almacenamiento de carbono. Los PHA son biodegradables y biocompatibles, constituyéndose como una buena alternativa a los plásticos petroquímicos, sus propiedades también son similares a las del polietileno (PE) y polipropileno (PP). Con el fin de satisfacer las normas industriales mínimas para la detección de organismos potencialmente útiles para la producción de PHA, han adoptado un enfoque polifásico para detectar microbios ambientales que puedan producir mcl-PHA y a su vez acumular una cierta cantidad de la misma antes de realizar la mejora de la tensión. Se recolectaron suelos de diferentes sitios, donde las bacterias aisladas de estos ambientes se examinaron para la producción de PHA, el medio utilizado para el aislamiento de microorganismos contenía extracto de levadura (5gl-1); triptona (8gl-1) y NaCl (2,5 gl-1). El PH de los medios se neutralizó y esterilizó antes de su uso, se inoculó suelo (0,5g) de cada muestra en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de medio. Los cultivos se controlaron directamente en busca de colonias fluorescentes mediante la exposición a luz ultravioleta para detectar la acumulación de compuestos de almacenamiento de lípidos, incluidos los PHA. Pseudomonas oleovorans BCRC10951 (ATCC8062) Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria Alimentaria en Taiwán Para el control positivo para las cepas productoras de PHA Pseudomonas nitroreducens BCRC11041 (ATCC33634) Universidad de Tsinghua de Beijing en China Pseudomonas putida KT2442 Para el control negativo para las cepas productoras de PHA Cupriavidus taiwanensis Universidad Yuan Ze en Taiwán Escherichia coli

3. Las células bacterianas se recolectaron y lavaron dos veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril, el ADN se extrajo de los sedimentos celulares mediante el método Triton – Prep, el cistrón de ARNr 16S se amplificó con cebadores universales bacterianos F24 Y F25 y luego se comparó con las secuencias disponibles en la base de datos del NBCI. v El ADN bacteriano se extrajo de los sedimentos celulares, donde los cebadores degenerativos phal – 1 y phal – 2, que se diseñaron de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de los genes pha C1 disponibles en GenBank. Poco después del programa de amplificación, las PCR se realizaron en gel de agarosa al 1% y el ADN se tiñó con bromuro de etidio y se visualizó con luz UV de onda corta. Se purificaron amplicones de PCR del tamaño esperado (800 pb) a partir del gel de agarosa de bajo punto de fusión (0,7%), los fragmentos de ADN purificados se clonaron posteriormente en un vector de clonación, el ADN plasmídico se aisló de E.coli transformada mediante un procedimiento de lisis alcalina. Los PHA se recuperaron de la masa celular seca mediante tratamiento con dodecilsulfato de sodio, estos fueron extraídos en un exceso de cloroformo a 60° C durante 24 h se sometieron a espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR), estos se analizaron mediante análisis de cromatografía de gases y análisis de resonancia magnética nuclear. v La incorporación de la identificación fenotípica en la estrategia de aislamiento demostró ser un enfoque útil en nuestro aislamiento de cepas potenciales que se utilizarán para la producción industrial de PHA. Una de las principales preocupaciones en la comercialización de PHA son los altos costos de producción de PHA producido biológicamente en comparación con los de la producción de materiales plásticos de base petroquímica. Los esfuerzos para reducir el costo de producción incluyen la mejora genotípica de las cepas microbianas de producción, el desarrollo de condiciones de fermentación eficientes y procesos de recuperación económicos.