TEST GENETICI NELLA INVESTIGAZIONE SU FRODI ALIMENTARI Enrico Novelli

1. TEST GENETICI NELLA INVESTIGAZIONE SU FRODI ALIMENTARI Enrico Novelli Dipartimento di Sanità Pubblica, Patologia Comparata e Igiene Veterinaria, Università degli Studi di Padova

2. Gli alimenti ECONOMICA NUTRIZIONALE energetica plastica regolatrice EDONISTICA ORGANOLETTICO SENSORIALE RELIGIOSA FUNZIONALE NUTRACEUTICA SICUREZZA ETICA

3. Gli alimenti contengono macrocomponenti acqua proteine grassi zuccheri minerali microcomponenti vitamine antiossidanti enzimi composti azotati non proteici gas disciolti acidi nucleici

4. La produzione degli alimenti Produzioni primarie Macellazione Mungitura Pesca Ovodeposizione Alveare Raccolta Conservazione Organolettica Stagionatura Fermentazione Caseificazione Cottura Sterilizzazione Congelazione Essicazione Acidificazione trasformazione Produzioni secondarie

5. Acqua evapora legata Proteine denaturazione proteolisi Grassi lipolisi ossidazione Zuccheri caramellizzazione prodotti di Maillard Minerali stato di ossidazione Acidi nucleici frammentazione Profonda e irreversibile modificazione delle proprietà chimico-fisiche dei macro e micro componenti trasformazioni componente più stabile tempo

6. L’aspetto economico delle produzioni alimentari implica Osservanza della legislazione alimentare Conoscenze tecniche Professionalità Lealtà e trasparenza

7. Sicurezza alimentare Sicurezza – Tracciabilità – Etichettatura (Reg. 178/2002) Etichetta e trasparenza (Dir. 13/2000) Etichetta e allergeni (Posizione comune 16/2003) Etichettatura carne bovina (Reg. 1760/2000)

8. Alcuni frodi alimentari e le rispettive filiere • Carne e prodotti a base di carne • residui di sostanze (additivi tecnologici, farmaci, ormoni) la cui presenza è conseguente al mancato rispetto dei tempi di sospensione; • uso fraudolento di promotori di crescita; • aggiunta di sostanze in grado di liberare SO2 (solfiti, bisolfiti, metabisolfiti,ecc) alle carni macinate allo scopo di prolungarne la vita conservativa evitando la comparsa di imbrunimento; • presenza di carni di specie diversa dal dichiarato; • impiego di sostanze leganti o altri additivi non consentiti (coloranti, antimicrobici); Fra i prodotti a base di carne frequente è la frode di falsificazione consistente nella vendita di prodotti generici, o di normale qualità, per prodotti di alta qualità o addirittura a denominazione di origine.

9. Latte • tenore in grasso differente al dichiarato; • trattamenti di risanamento non consentiti; • latte ottenuto dalla ricostituzione del latte in polvere; • aggiunta di sostanze a potere battericida; • Formaggi • formaggi ottenuti con latte in polvere ricostituito (in tutto o in parte); • formaggi pecorini contenenti percentuali più o meno elevate di latte vaccino; • mozzarelle di bufala contenenti percentuali più o meno elevate di latte vaccino; • applicazione del marchio di tutela a formaggi comuni;

10. Prodotti della pesca • vendita di prodotti non freschi per freschi; • vendita di prodotti non rispondenti alla qualità richiesta (vendita di un prodotto di basso pregio per uno di alto pregio, esempio vendere pagro o pagello per dentice, totano per calamaro, ecc.); • vendita di prodotto decongelato per fresco; • Utilizzo fraudolento di sostanze igroscopiche • Miele • aggiunta di zuccheri; • vendita di un miele di una origine botanica diversa da quella dichiarata; • vendita di mieli extracomunitari per mieli italiani senza la relativa dichiarazione in etichetta;

11. Olio • olio extravergine contenente oli raffinati, sia di oliva che di semi; • oli con tenori analitici non rispondenti ai requisiti previsti dai regolamenti comunitari; • Pasta • uso di farine di grano tenero (compromette le qualità organolettiche della pasta); • impiego di altri cereali meno costosi (e conseguente decadimento qualitativo); • uso di semole di qualità scadente o avariate; • aggiunta di coloranti o di additivi chimici per imitare le paste speciali o le paste all'uovo o per mascherare il tipo di sfarinato usato;

12. Riso • varietà di pregio minore a quella indicata; • miscela di diverse varietà; • vendita di riso proveniente dall'estero come se fosse prodotto nazionale;

13. Trasformazione Frutta e verdura Preparazione domestica Latte e carne Vendita al dettaglio Consumo Magazzino Prodotti ittici Distribuzione Nelle produzioni alimentari si ragiona in termini di Partita

14. ………..da un punto di vista strettamente tassonomico Famiglia Specie Razza e Ceppo

15. Famiglie differenti Cernia Tonno

16. Sogliola (Solea vulgaris) Passera pianuzza (Platichthys flesus flesus) Famiglie differenti

17. Sogliola (Solea vulgaris) Sogliola dal porro (Solea lascaris) Specie differenti Foto e testo tratti da: Enciclopedia illustrata delle SPECIE ITTICHE MARINE – Paolo Manzoni – I.G. DeAgostini

18. Orata (Sparus aurata) Salpa (Salpa salpa) Generi differenti Foto e testo tratti da: Enciclopedia illustrata delle SPECIE ITTICHE MARINE – Paolo Manzoni – I.G. DeAgostini

19. Prodotto in filetto

20. Gli squali

21. Vertebra asterospondila Vertebra tettospondila smeriglio, palombi, pesce volpe, squalo elefante, verdesca, pesci martello razze, squadri Vertebra ciclospondila Vertebra pseudoasterospondila spinaroli, gattuccio torpedini, squalo manzo Gli squali

22. I controlli sono difficili… VENDITA DEL PESCE IN FILETTI, NON INTERO SPESSO SURGELATO GRANDI QUANTITA’ CONTROLLI DIFFICOLTOSI GDO

23. D. M. 14 Gennaio 2005 ALLEGATO Elenco delle denominazioni in lingua italiana delle specie ittiche di interesse commerciale *Già presenti nel D.M. 27 Marzo 2002

24. Nell’attività di ispezione, vigilanza e controllo degli alimenti interessano Specie Sesso Età Origine Presenza di residui (biologici, chimici, fisici) Additivi non consentiti Microrganismi patogeni

25. Sospetto Determinare se vi è stata una sostituzione di specie Conosco la tassonomia e dispongo di standard e sequenze Non ho alcuna informazione tassonomica Cyt b mitocondrio PCR con primer universali Analisi del profilo di restrizione (RFLP) Cyt b mitocondrio PCR con primer universali Sequenziamento Confronto con sequenze pubblicate

26. Sospetto Determinare se vi è stata una sostituzione di specie Conosco la tassonomia e dispongo di standard e sequenze Non ho alcuna informazione tassonomica Cyt b mitocondrio PCR con primer universali Analisi del profilo di restrizione (RFLP) Cyt b mitocondrio PCR con primer universali Sequenziamento Confronto con sequenze pubblicate

27. Citocromo b (359 bp) Marcatore di riferimento M M I S G SaA P P Mustelus mustelus (M) palombo Necessità di applicazione di tecniche più “potenti” per discriminare soggetti dello stesso genere Mustelus asterias (M) palombo Isurus oxyrinchus (I) smeriglio Scyliorhinus canicula (S) gattuccio Galeorhinus galeus (G) canesca RAPD - AFLP Squalus acanthias (Sa) spinarolo Alopias superciliosus (A) squalo volpe Prionace glauca (P) verdesca

28. Polimorfismo batteri del genere Bacillus tecnica RAPD con primer da 10 bp

29. Sospetto Determinare se vi è stata una sostituzione di specie Conosco la tassonomia e dispongo di standard e sequenze Non ho alcuna informazione tassonomica Cyt b mitocondrio PCR con primer universali Analisi del profilo di restrizione (RFLP) Cyt b mitocondrio PCR con primer universali Sequenziamento Confronto con sequenze pubblicate

30. Totale concordanza fra la sequenza campione “PIPPO” e quella nota “PLUTO” identificato!

31. FREQUENZA DEGLI ALLERGENI ALIMENTARI(Popolazione colpita in occidente) Alimenti Frequenza(%) Pesce 16,3 Uova 14,9 Latte 13,8 Crostacei 13,8 Sedano 6,9 Farina 4,8 Frutta secca 4,7 Mele 4,4 Pesche 4,3 Leguminose 3,8 Patate 2,5 Carne di maiale 1,3 Banane 1,2 Fragole 1,2 Uva 1,1 Yogurt 1,0 Carne di pollo 0,9 Melanzane 0,9 Arance 0,9 Carciofi 0,9 Allergia Intolleranza Reazione immunitaria Reazione metabolica Allergeni alimentari Responsabili del 9% circa dei casi di shock anafilattico. Nei bambini gli allergeni alimentari sono rappresentati essenzialmente dalla proteine del latte, dell’uovo e del pesce, nonché da alcuni vegetali (ad esempio dalle arachidi). Negli adulti sono costituiti soprattutto da alimenti di origine vegetale.

32. Direttiva Europea 2003/89/CE Gli ingredienti o le sostanze derivate dai seguenti allergeni alimentari – cereali contenenti glutine, crostacei, uovo, pesce, arachide, soia, latte, frutta con guscio, sedano, senape, semi di sesamo – utilizzati nella produzione alimentare e presenti nel prodotto finito devono essere obbligatoriamente segnalati in etichetta indipendentemente dalla quantità. Alimenti compositi che ne possono contenere: prodotti di pasticceria e di gelateria, alcuni prodotti di salumeria (insaccati: salame, mortadella, etc.; prosciutto cotto, würstel, alcune margarine), prodotti di gastronomia (salse, creme e zuppe vegetali, alimenti preconfezionati o in scatola, etc.) Proteine del latte Proteine dell’uovo Alimenti compositi che ne possono contenere: paste speciali, prodotti dolciari e di gelateria, cibi impanati e fritti, maionese e salse in genere, marsala all’uovo, etc.

33. Utilizzo di carne diversa da quella dichiarata Insaccati Prodotti in taglio Danno economico (DOP) Rischio sanitario Aspetti etici e religiosi Acidificazione Sale Disidratazione tempo Difficilmente applicabili tecniche immunoenzimatiche e elettroforetiche Mozzarella di bufala Formaggio pecorino Aggiunta fraudolenta di latte vaccino Danno economico (DOP) Rischio sanitario Acidificazione Filatura Sale Disidratazione Tempo Difficilmente applicabili tecniche immunoenzimatiche e elettroforetiche

34. 5 bufalo 6 bufalo 7 bufalo e bovino 8 bufalo e bovino In alimenti compositi poligrana vi è la necessità di operare con oligonucleotidi specifici per la specie animale d’interesse RFLP Vantaggi Elevata accuratezzae sensibilità Svantaggi Possibilità di rilevare tracce di contaminazione accidentale (difficile interpretazione) Limite di sensibilità 3-10% in funzione di temperatura di cottura concentrazione salina quantità d’acqua

35. Sonda integra Sonda idrolizzata Analisi dell’amplificato in tempo reale (Real Time) mediante misura della fluorescenza emessa da un frammento di una sonda 218 141 191 168 1 2 3 4 5 6 7 8

36. L’analisi molecolare “Real Time” ovvia agli inconvenienti/limiti di quella “End time” Sensibilità (0,01% vs 0,001%) Limitato intervallo di linearità (< 2 Log) Bassa risoluzione Non automatizzabile Discriminazione basata sul peso molecolare Utilizzo di etidio bromuro Obbligo di analisi post PCR L’analisi “Real Time” oltre che qualitativa può essere quantitativa Etichettatura degli alimenti contenenti ingredienti OGM > 0,9% (Reg. 1829/2003/CE)

37. Ricerca di allergeni negli alimenti ELISA (immunoenzimatico) “Real Time” PCR Proteina allergenica Ingrediente allergenico Rapido Facile esecuzione Strumentazione semplice Buona sensibilità Falsi negativi Falsi positivi Più rapido della “end time” Conoscenze e abilità tecniche Strumentazione più complessa Elevata sensibilità Specifico

38. Applicazioni in campo zootecnico Emergenza BSE Relazioni con casi di malattia di Creutzfeldt-Jakob (nvCJD) nell’uomo Bando all’uso di proteine derivate dai ruminanti (MBM) per l’alimentazione degli stessi MBM (Meat and Bone Meal) ottenute con drastici trattamenti termici (130 °C – 2 bar – 20 min) Impensabile o estremamente aleatorio l’utilizzo di tecniche immunoenzimatiche per la loro identificazione

39. 1 e 3: DNA estratto da mangime 2: DNA estratto da farina di carne 1 2 3

40. Carne in scatola 1: DNA estratto da gelatina 2: DNA estratto da carne 1 2

41. Amplificato di DNA della specie bovina (farina animale) estratto da mangime Concentrazione 1: 3% 187 bp 1 2 3 4 5 2: 1% 3: 0,5% 4: 0,125% 5: 0,0625%

42. Selezione genetica e disciplinari di produzione La suinicoltura riveste un ruolo di primo piano nel settore agroalimentare italiano mangimistica riproduzione e ingrasso macellazione trasformazione Grande impegno gestionale e economico per il miglioramento della qualità genetica quantitativa (QTL) biotecnologie nutrizione e allevamento La suinicoltura italiana presenta delle peculiarità che sono funzione dei prodotti di salumeria di alto pregio che la caratterizzano

43. Programma di selezione per l’eliminazione dei riproduttori potenzialmente PSE (miopatia essudativa) La PSE ha la stessa base ereditaria dell’ipertermia maligna (MH), una sindrome che si manifesta in seguito al trattamento anestetico con alotano (singolo gene recessivo) Le tecniche biomolecolari hanno permesso di individuare, nei soggetti portatori di MH, una mutazione nel gene che codifica la proteina che costituisce i canali che controllano l’eflusso di calcio durante la contrazione muscolare (Fujii et al., 1991)

44. DNA RNAm arginina CGC CGC TGC UGC cisteina Isolati tre genotipi nei confronti della sensibilità all’alotano Hal 1843™potenzialmente PSE

45. Restrizione dell’amplificato (74 bp) con Hin PI La mutazione CGC TGC faperdere il sito di restrizione per Hin PI 74 41 33 Nn NN nn NN non sensibile dominante Nn non sensibile nn sensibile recessivo Eliminati, nei centri di riproduzione, i soggetti nn e Nn

46. Considerazioni conclusive Chi produce e somministra alimenti deve garantire la sicurezza dei propri alimenti verso il consumatore (istituto dell’autocontrollo D. Lgs 155/97); il controllo ufficiale svolge funzione di supervisione, consulenza e verifica (D. Lgs 123/93) Le tecniche di laboratorio biomolecolari si presentano come strumenti nuovi e efficaci a supportare l’attività di chi produce gli alimenti e di chi tutela la salute pubblica Le potenzialità applicative sono vaste (controllo della specie animale o vegetale utilizzata fino all’identità dell’individuo) Ci vuole chiarezza nella definizione degli obiettivi per la scelta degli strumenti più adatti alle finalità da perseguire (aspetti economici)