Analisi cromatografica su strato sottile di coloranti alimentari

1. Analisi cromatografica su strato sottile di coloranti alimentari A cura di Federico Rusconi, dottorando dell'Università dell'Insubria

2. Cromatografia su strato sottile Thin Layer Chromatography T.L.C. Tecnica analitica (qualitativa) : Materiale richiesto – Terminologia : • “Lastrina”: supporto di vetro omogeneamente rivestito • di materiale adsorbente (silice) • Camera di sviluppo • Eluente opportunamente scelto • Capillari per la deposizione delle soluzioni • Campione da analizzare – Standards di riferimento Scopo : Individuare i coloranti impiegati in un determinaro alimento.

3. Decreto Ministeriale del 31 marzo 1965 sulla "Disciplina degli additivi chimici consentiti nella preparazione e per la conservazione delle sostanze alimentari", articolo 3: "Sono considerati additivi chimici quelle sostanze, prive di potere nutritivo o impiegate a scopo non nutritivo, che si aggiungono in qualsiasi fase di lavorazione alla massa o alla superficie degli alimenti per conservare nel tempo le caratteristiche chimiche, fisiche o fisico-chimiche, per evitare l'alterazione spontanea o per impartire ad essi, oppure per esaltarne favorevolmente, particolari caratteristiche di aspetto, di sapore, di odore o di consistenza".  Coloranti Conservanti Antiossidanti Emulsionanti Addensanti Agenti gelificanti Stabilizzanti Esaltatori di sapidità Acidi Regolatori di acidità Amidi modificati Edulcoranti … I colorantisono sostanze che conferiscono un colore ad un alimento o che ne restituiscono la colorazione originaria, ed includono componenti naturali dei prodotti alimentari e altri elementi di origine naturale, normalmente non consumati come alimenti né usati come ingredienti tipici degli alimenti.

4. ★ Coloranti Alimentari ( prima cifra della sigla: 1) : I coloranti gialli e arancione: E100 - E111 I coloranti rossi: E120 - E129 I coloranti blu: E130 - E133 I coloranti verdi: E140 - E142 sono polveri colorate, tipicamente solubili in acqua. ★ Esempi di strutture molecolari: E132 : Indigotina 2,2'-Bi(2,3-dihydro-3-oxoindolylidene)-5,5'-disulfonic acid disodium salt E131 : Blue Patent V E102 : Tartrazina 4,5-dihydro-5-oxo-1-(4-sulfophenyl)-4-[(4-sulfophenyl)azo] -1H-Pyrazole-3-carboxylic acid, trisodium salt Ethanaminium, N-[4-[[4-(diethylamino)phenyl](2,4-disulfophenyl)methylene] -2,5-cyclohexadien-1-ylidene]-N-ethyl-, inner salt, sodium salt

5. Cos’è la Cromatografia ? E’ la tecnica più diffusa ed efficiente per la separazione analitica di diversi componenti di una miscela. Grazie alle sue notevoli potenzialità trova applicazione in tutte le branche della scienza. In molti casi, i prodotti organici che si formano in una reazione chimica –oppure che sono presenti in una matrice naturale- non possono essere separati o purificati tramite • estrazione con solvente • ricristallizzazione • distillazione perché le proprietà chimico-fisiche dei componeti sono troppo simili tra loro, e le differenze non sono apprezzabili e tali da consentire la separazione.

6. Come e quando fu scoperta ? Nel 1906 il biochimico Mikhail Tswett adottò questa tecnica per separare i vari pigmenti di un estratto vegetale. γράφειν κρόμα CROMATOGRAFIA =+ “colore” “scrivere”

7. La cromatografia può essere definita come la separazione di una miscela in varie frazioni per distribuzione dei componenti tra due FASI tra loro immiscibili : FASE STAZIONARIA (immobile) FASE MOBILE ► A seconda del tipo di fase mobile e fase stazionaria, è possibile classificare: ► Inoltre, a seconda della modalità fisica mediante la quale è assicurato il contatto tra la fase mobile e quella stazionaria, si hanno: Cromatografia su colonna Cromatografia planare

8. La tecnica sperimentale prevede la dissoluzione della miscela campione in una fase mobile (liquida o gassosa). La fase mobile viene fatta passare attraverso una fase stazionaria (generalmente un solido o un gel) posto in una colonna o su una superficie solida La miscela da separare è “trascinata” dalla fase mobile in modo dinamico: il componente della miscela che interagisce di più con la fase stazionaria è quello che viene RITARDATO di più, e viceversa. Ovvero la separazione è possibile nel momento in cui i diversi componenti tendono a ripartirsi in modo diverso fra le due fasi, in funzione del loro grado di affinità con ciascuna di esse! FASE STAZIONARIA

9. tempo tempo TLC : cromatografia planare • L’importanza della TLC è dovuta a : • basso costo • velocità con cui è possibile eseguire separazione cromatografica • possibilità di scegliere un opportuno solvente (eluente) che poi verrà utilizzato • per la colonna cromatografia su colonna, dunque su più larga scala

10. Come si esegue una TLC • Tracciare la linea di partenza (linea di deposizione) con una matita • Per mezzo di un capillare deporre alcune gocce delle soluzioni delle • diverse sostanze • Si pone la lastrina nella camera di eluizione contenente la miscela • eluente opportuna • Si nota che il solvente sale per capillarità lungo la fase stazionaria • Quando il solvente ha raggiunto i bordo superiore della lastrina, • la si estrae e si segna a matita il “fronte del solvente” • Si analizza la lastrina con un opportuno metodo: • analisi visiva • esame della lastrina sotto lampada UV • lastrina immersa in reattivi tali da colorare le macchie • -e non la fase stazionaria- (H2SO4, vapori di iodio, ninidrina, …) • Valutazione degli Rf

11. Cos’è il fattore di ritenzione Rf Per ogni composto: distanza percorsa dalla sostanza Rf = distanza percorsa dal solvente B distanza percorsa dall solvente d (B) d (A) Rf (A) = A d solv d (A) d (B) Rf (B)= d solv Il valore di Rf di uncomposto è una costante fisica, per quelle determinate condizioni cromatografiche di eluente e fase stazionaria, e può servire a caratterizzare quel composto.

12. Procedura sperimentale La fase di estrazione è così eseguita: Si lavano 5-6 caramelle di colore verde in circa 4ml di H2O a temperatura ambiente. La sospensione verde presenta una parte solida derivante dall’agente di rivestimento (cera di carnauba) : esso viene allontanato tramite filtrazione. Eventualmente la soluzione ottenuta è concentrata per evaporazione. Di ciascuno dei quattro coloranti puri ( E102, E104, E131, E132) a disposizione, si prepara la rispettiva soluzione acquosa; si ottengono così le quattro soluzioni di riferimento. L’eluente è costituito da una miscela di solventi, ed è così preparato: 25ml di n-butanolo 25ml di etanolo 12,5ml di H2O 5ml di NH3 al 25% Sulla lastrina vengono depositati i quattro standard di riferimento, e la soluzione campione.