내생포자 ( Endospore)

1. 스포아자임 내생포자 (Endospore) & 보리종실(맥아) 발아효소 우진B&G㈜

2. Sporezyme 천연 맥아발아효소 + 미생물유래효소 + C.butyricum endospore + B. subtilis endospore + Sacchromyces cerevisiae

3. Sporezyme -Sporezyme은 Phytezyme의 천연식물성 맥아발효효소 활성복합체에 + 광범위한 미생물 효소활성과 동시에, 강력한 항균활성을 발휘하는 Clostridium butyricum 과 Bacillus subtilis의 내생포자(endospore)를 이상적으로 배합하여 식물성효소와 미생물효소활성 및 생균의 항균활성의 시너지 효과로 가축의 생산성 극대화와 항병력을 강화하도록 설계한 고효율 저비용 사료첨가제입니다.

4. Sporezyme Composition Clostridium butyricum endospores ------------------109 cfu 이상 / kg Bacillus subtillus endospores ----------------------1010 cfu 이상 / kg Malt enzyme activities; (Phytezyme 96.5% ) /kg Xylanases ----------------------------------50,000 unit ß-Glucanases ------------------------------30,000 unit Amylases -------------------------------1,500,000 unit Cellulase ----------------------------------40,000 unit Acid-phosphatases ---------------------11,000,000 unit Phytase -----------------------------------90,000 unit Proteases --------------------------------300,000 unit Lipase---------------------------------------500 unit Saccharomyces cerevisiae ---------------------------108 cell 이상/kg Recommandation : 1~2kg / 1ton of feed

5. Sporezyme 등록사항 사료의 종류 : 보조사료 사료의 명칭 또는 용도 : 생균제 (용도:사료첨가제) 사료의 성분량 Clostridium butyricum ----------- ------------------106 cfu 이상 / g Bacillus subtillus ----------------------------------107 cfu 이상 / g 사용원료 : Malt 사용방법 : 1~2kg / 사료1ton

6. Endospore정의 • 미생물이 영양분이 부족하여 더 이상 영양생식을 할 수 없을 때 생성되는 휴면상태의 세포 • 대표적인 내생포자 생성균은 Bacillus, Clostridium, Sporosarcina속 등이 알려져 있다. • 특 징 : 열 및 자외선, 감마선, 화학 살균제, 건조한 환경 등의 불리한 환경조건에서 생존성이 아주 우수 (100,000년 가량 생존해 있다가 발견) (진흙 속 에 7,500년 동안 묻혀 살아있는 채로 발견)

7. endospore Bacillus subtilis Endospore Bacillus coagulance Endospore Clostridium butyricum Endospore

8. Table. Difference of vegetative cells and endospores

9. Endospore발견이 인류에게 미치는 영향 1. 생물 발생설 > 자연발생설 2. 멸균개념 재확립 순수배양 가능 식품산업의 발전 의학의 발전 3. 미국 9.11 사건 : 공포의 백색 가루

10. 축산업에서 미생물이 활동하는 분야 정장 장용 소화력 증대 면역력 증대 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobateria, Aspergillus. Saccharomyces, Bacillus, Clostridium • 가축 대사 분야 축분 액비화 가축분뇨 악취 및 해충감소 가축분뇨 퇴비화 촉진 Lactobacillus, Pseudomonas, Rhodopseudomonas(PTB,포토). Nitrosomonas, Nitrobater, Bacillus  환경 개선 분야 항생제 소화 효소 유기산 다당류  원료 생산 분야 Bacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Streptomyces

11. 미생물 원료 성상 및 생산 방식 배양액 냉동 건조 (-40도) 숙 성 농 축 • 비내열성 균주 • 균수 > 발효생성물 • 냉장보관 • 건조비용 증대 열풍 건조 (40~50도) 분무 건조 (200도) • 포자만 가능 • 균수 > 발효생성물 • 저장성이 길다 • 실온보관 • 생산량이 많다 (건조비용감소) • 균수 < 발효생성물 • 내열성 균주 • 저장성이 짧다. • 실온보관 • 생산량이 적다 (건조비용증대) Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacteria, Rhodopseudomonas. Nitrosomonas, Nitrobater Aspergillus. Sacchromyces, Bacillus Bacillus의 포자 Clostridium의 포자

12. 우진의 Endospore생산공정 Seed 배양 분무건조 (In temp.200oC) 메인 배양 (15kL, 20kL) 농축

13. 사료 첨가용 생균제 원료로 Endospore Type이 적합한 이유? 1. 사료제조 공정상 고온의 열에 노출 (75~80℃) 2. 각종 화학물질에 노출 3. 원료 보관이 장기간 용이 4. 급여했을 때 가축의 장관까지 안전하게 도달

14. 그림. 80℃에서 20분간 열처리에 따른 생균제의 생존율

15. 생존율,% Time (hr) 그림. 산성조건(pH 2.5) 생균제의 생존율

16. 그림. 항생물질에 대한 생균제의 안정성(1) 각각의 균주 배양액에 일정량의 항생제를 넣고 1시간 가량 방치한 후, 0.2um 필터로 여과하여 균체를 회수하고, 멸균 증류수(5,000ml)로 5회 세척한 하여 잔존하는 항생제를 제거한 후, 균수를 측정한다

17. 티아물린(11ppm) 그림. 항생물질에 대한 생균제의 안정성(2) 각각의 균주 배양액에 일정량의 항생제를 넣고 1시간 가량 방치한 후, 0.2um 필터로 여과하여 균체를 회수하고, 멸균 증류수(5,000ml)로 5회 세척한 하여 잔존하는 항생제를 제거한 후, 균수를 측정한다

18. Clostridium butyricumendospore

19. Clostridium butyricum의 효용성 • -宮人近治가 1935년, 장내용물로부터 항부패성을 갖는 혐기성 포자형성균 Clostridium butyricum을 보고한 이래, Cl. butyricum균은 장내에서 각종 소화효소를 대량으로 분비하여 소화를 촉진하고, 낙산과 초산을 생성함으로써 장내 Ph를 저하시켜 유해세균에 대한 길항작용과 유산균의 증식을 촉진하는 작용에 대해 많은 연구가 이루어져 왔고, 포자형성균으로 장기 보관이 가능하기 때문에 인체에서도 정장제로 개발되어 오래전부터 널리 이용되고 있으며, 각종 임상적인 효과와 함께 최근에는 종양세포를 선택적으로 파괴하는 Kininase효소 생성능도 발표되고 있다. 다음은 Clostridium butyricum의 효용성에 대한 최근 연구 요약결과이다; • 장관내에서 고농도의 short-chain fatty acids,(SCFAs-n-Butyrate, Acetate)를 생성하여 각종 소화기질병을 예방,치료하고, Lactobacillus bifidus 등 유산균의 증식을 촉진하고, E.coli, Salmonella, Candida, Cl.paraputrificaam 등 유해세균의 성장을 억제하며 성장을 촉진한다.-Akira Andoh(Shiga Univ)등, Int’l J. of Molecular Medicine 9, 2002 • 장기투여시 혈청 Lipid 수준을 감소시키고 대장의 발육과 무게를 증가시킨다. -Akira Andoh(Shiga Univ)등, Int’l J. of Molecular Medicine 12, 2003 • 비타민 B 그룹의 대량 생산 및 암모니아 농도의 현저한 감소-Akira Andoh(Shiga Univ)등, Int’l J. of Molecular Medicine 9, 2002

20. Clostridium butyricum의 효용성 4. 식이성섬유소인 NSP(Non-Starch Polysaccharides) 분해효소 즉, 세포외효소인(extracellular enzymes) Laminarinase( endo-1,3-β-glucanenase, endo-1,4-β-mannanase, endo-and exo-pectatelyases & Pectin methylesterase)를 대량 생성하여 이들을 Oligosaccharides로 분해하고 이어서 short-chain fatty acid로 발효시킨다.-N.Nakajima 등, Appl Microbiol Biotechnol (2002), 59 5. 국소 점막성면역(local mucosal immunity)을 활성화하고, 콜레라 톡신의 공격접종에 대한 IgA 분비가 증가되고, Peyer’s patch 세포 상층부에 IgA,IgM과 IgG 생성을 현저히 증가시킴. 즉, 다클론성(polyclonal) 점막면역을 활성화 한다.-Taka-ichi Murayama 등, Vet. Immunology & Immunopathology 48, 1996 6. 생균제제의 성장촉진 효과에 관한 연구-Ⅱ.브로일러에 대한 Clostridium butylicum ID의 성장촉진 효과와 분변 및 장내 세균총의 변화에 미치는 영향—한 등, 한축지: 26(2),1984 7. 생균제제의 성장촉진 효과에 관한 연구-Ⅲ.자돈에 대한 Clostridium butylicum ID의 성장촉진 효과와 분변내 세균총의 변화에 미치는 영향—한 등, 한축지: 26(2),1984

21. Bacillus subtilis endospore

22. Bacillus subtilis의 효용성 • Bacillus의 몇 종은 식품제조에 이용되고 있어 그 안정성이 확립되어 있으며, 다양한 효소활성을 발휘하는 대표적인 미생물로서 식품과 퇴비발효균이며, 포자의 형성으로 열과,산 및 습기에 강하고 특히, 비흡수성 성장촉진제인 Enramycin이나 Bacitracin등과 같은 polypeptides형 항균물질을생성하기 때문에 생균제로써 적합한 특성을 구비하고 있다. • 세균이 생성하는 항균물질인 박테리오신은 세포외로 분비되는 peptides나 단백질로써 생산균주와 근연관계의 미생물을 죽이거나 생육을 저해하는 물질이다. • 기존의 항생물질은 대사산물인데 반해 박테리오신은 자신의 유전자로부터 직접 생합성( ribosomal translation)되며, 단백질이나 peptide분자로 이루어져 소화기관내에서 단백분해효소에 의해 분해됨으로써 생체에 무독성이고, 잔류성이 없다는 특성이 있다. • 이러한 특성으로 박테리오신은 식품에서의 생물학적 보존제로, 식물병원균을 저해하는 무독성 미생물농약으로, 가축의 질병예방 목적 등에 이용될 수 있다.

23. Bacillus subtilis의 효용성 • 산업적으로 유용한 대표적인 박테리오신은 nisin으로 1988년 FDA에서 GRAS (generally regarded as safe)로 공식 공인된 후로 식품산업에 광범위하게 사용되고 있다. 그러나 nisin은 PH에 대한 안정성이 떨어지는 경향이 있다.( PH2조건; 안정, PH5조건: 40%, PH6.8조건: 90% 역가손실) • 따라서, Bacillus subtilis는 단독 사용 보다 단쇄지방산을 대량생산하여 소화관내PH를 떨어뜨리는 Clostridium butyricum 등과 같이 병용할 때 더욱 효과적이며, 포자균(endospore)일 때 효용성이 배가될 수 있다. Bacillus subtilis 중에서도 광범위한 PH 안정성( 2.5~9.5)을 나타내는 균주도 있다. • Bacillus subtilis의 항균물질은 subtilin, botrycin, fengycin, iturin, rhizocticins, surfactin 등이며 대부분 peptide antibiotics 으로 보고되고 있다. • 이와같은 Bacillus subtilis가 생성한 항균성물질은 다른 균주들 보다 자체군주에 선택적인 잇점을 부여한다. 그람 양성세균에 의해 생성된 Bacteriocin은 세포막투과성 양이온(memberane-permeablizing cationic) peptides로서 60개 미만의 아미노산 분획(residues)을 가진다. Bacillus으로부터 생성된 bacteriocin 중에서 아미노산과 DNA 서열 수준으로 특성이 규명된 것은 Bacillus subtilis가 생성한 subtilin과 subtilosin 뿐이다.

24. Bacillus subtilis의 효용성 Bacillus subtilis가 생성하는 항균물질(subtilein)의 열 안정성

25. Phytezyme 천연 맥아발아효소 + 미생물유래효소

26. 천연식물발아효소의 효용성 독일 Fraunhofer연구소 발아된 곡물을 사료에 배합함으로써 사료중 P, Zn, 등의 미네랄과 Vitamin의 이용율을개선하여 별도의 미네랄 첨가량을 줄일 수 있었을 뿐만 아니라, 가축 분뇨중의 질소(N)와 인(P) 의 배설량을감소시켰으며, 발아된 씨앗에는 항생제, 단백질분해효소 및 다른 분해인자들이존재하는 것도 확인 했다. - Dr. Manfred-karl otto of IGB 등 – (바이오인더스트리 1998.7.)

27. 천연식물발아효소의 효용성 캐나다 Saskatchewan대학 “보리에서 생성된 amylase는 고온에서는 물론, 저온에서도 비용해성의 밀(wheat) 전분을 분해 하는데 다른 amylase보다 분해력이 월등히 뛰어 났다”고 발표했다. (industrial bioprocessing; vol.21.no.1)

28. 천연식물발아효소의 효용성 -발아와 효소활성 곡물의 발아가 진행될 때에는 무기물을 비롯한 충분한 양의 영양소를 빠르게 요구한다. 이러한 요구를 신속하게 충족시키기 위해 종실 내에는 생명체의 생장을 위한 각종 영양소가 고농도로 축적되어 있으며, 축적된 영양소를 빠르게 분해 이용할 수 있는 강력한 효소활성과 같은 생리활성 물질이 고농도로 생성되는 특성을 나타낸다. 종실 내 축적영양소의 분해를 위해 amylase, xylanase, β-glucanase, phytase(phosphatase), lipase 및 protease등을 비롯한 다양한 효소활성을 필요하게 되며, 발아를 위해 최적의 기질특이성으로 선택적 작용을 하게된다.(Godfrey and West 등,1996) 이러한 효소활성은 항상 종실내에 풍부하게 있는 것이 아니라 발아를 위한 생리적 변화와 일정한 환경이 갖춰지면 급속히 증가된다.

29. 천연식물발아효소의 효용성 -발아 보리의 효소활성 보리의 발아 전,후 상대적 효소 생성량 변화 보리 종실은 발아와 함께 각종 효소활성이 크게 증가함

30. 천연식물발아효소의 효용성 -발아 보리의 효소활성 자료: Godfrey 와 West (1996) ; Industrial Enzymology (2nd ED) -발아보리는 고도의 전분 당화력을 나타내는데 미생물 유래 amylase가 전분의 68%를 다당류인 dextrin 까지만 분해하는데 비해 , 발아amylase는 60% 이상을 sugar (2당) 수준까지 분해할 수 있음을 보여주는데 이는 맥아 amylase만이 전분을 엿으로 만들 수 있음을 증명하는 것이다.

31. 천연식물발아효소의 효용성 옥수수,밀 등 곡물과 대두박,채종박 등의 유박은 배합사료 원료의 대부분을 구성하고 있다. 이러한 사료 원료는 protein, starch 및 lipids 등 영양소와 이를 저장하고 세포벽을 구성하며 건조를 방지하고 보호막을 형성하는 구조 다당류인 식이성섬유소 NSP (Non-Starch Polysaccharides) 로 세포가구성되어 있다. 이 NPS는 일반 당류와 달리 알파(α)와 베타(β)결합으로 복잡한 구조를 이루고 있는데 단위동물의 소화기관에서 분비되는 내생효소(endogenous enzyme)로는 이러한 베타결합을 분해할 수 없다.

32. 천연식물발아효소의 효용성 NSP는 수용성NSP와 불용성NSP로 구분되며, 불용성NSP는 항영양인자로서 pectin, β-glucan, arabinoxylan 등이며, 수용성NSP는long-chain으로 연결되어 물분자를 포획하는 network 역할을 함으로써 소화관 내에서 장관내용물의 점도를 높여 장관 통과속도를 감소시킴으로써 불용성NSP와 함께 사료영양소의 소화를저해하여 미소화영양소가 장관 하부로 이동함으로써 유해미생물에 의한 혐기적 부패발효를 일으키게 하고, 대사산물인 세균독소가 장관벽을 자극, 수분 배출이 증가되어 분변의 수분함량을 증가시키고 각종 소화기장애를 일으키고 설사를유발하게 한다. 사료내 적절한 외생 NSP효소(exogenous NSP enzyme; Xylanase, β-glucanase, pectinase 등 )가 함유되어 있어야 소화관내 내생효소와 함께 최적의 소화율을 나타낼 수 있게 된다. 사료내 고농도로 함유된 유기태인 또한 항영양인자로써작용하여 다양한 사료 영양소의 이용율을 저해하고, 소화관내 내생효소의 활성을 저하시키며, 환경오염의 주요 원인인 인과 질소 배출을 증가시켜 이에 대한 대책도 매우 중요하다.

33. 천연식물발아효소의 효용성 • 곡물에는 고농도의 유기태인(organic phosphate)을 함유하고 있는데 , 이들의 약 60%가 단위동물이 이용할 수 없는 피틴태 인 (phytate P)으로 존재한다. • 보리에는 다른 곡물에 비해 유기태 인 함량이 높을 뿐만 아니라(약 1.9~2.5%), 발아과정에서 고도의 유기태인 분해효소(Phosphatase) 활성이 크게 증가된다. • 항영양인자로써 작용하는 곡물의 유기태 인을 효과적으로 분해함으로써, P와 결합되어 있는 Ca, Mn, Cu, Zn 등 각종 미네랄과 단백질의 이용율을 극대화시킬 수 있다.

34. 천연식물발아효소의 효용성 주요 사료원료내 피틴태 인(P)의 함량과 Phytase의 활력1) 1) 한 단위는 37℃와 pH 5.5의 표준분석 조건하에서 5.1 mM의 sodium phytase로부터 1분 동안 1μmole의 무기태 인을 유리시키는데 필요한 효소의 양 자료 : Pointillart, 1993

35. 천연식물발아효소의 효용성 발아보리내의 효소함량

36. 식물유래 phytase와미생물유래 phytase의 열안정성 비교 효소활성도% 10분간 가한 온도(℃)

37. Phytezyme의 특징 Phytezyme은 발아 보리가 생성한 여러 종류의 식물성 효소에 미생물유래 효소를 보강 복합하여 상호 상승작용을 갖도록 한 복합효소제이다.여러형태의 유기태 인(P)과 곡물중의 다양한 영양소의 분해를 위해서는 이와 같은 상승작용이 필요하며, 이는 적은 역가의 Phytase 로도 여러 형태의 인(P)을 충분히 분해하는 역할을 수행할 수 있게 한다.

38. Phytezyme의 특징 또한 여러 종류의 탄수화물 분해 효소들의 상호상승작용에 의해 분해력이 매우 높게 되기 때문에 곡물중의 비전분성 다당류(NSP)를 포함한 모든 에너지원의 소화율을 향상 시킴으로써 사료의 총 에너지량을 상승시킨다.

39. Phytezyme의 효과 ▣소화율 향상에 의한 사료효율 개선 ▣ 식욕증진 및 소화기 기능 강화 ▣ 각종 효소들의 상승작용으로 항영양물질 이용율 향상 ▣ 총에너지량 증가 및 광물질 이용증진으로 사료배합비 조정가능 ▣ 질소(N)및 인(P)의 배설량과 분변량 감소 ▣ 활성효모균의 첨가로 정장작용 ▣ 환경오염 최소화

40. Phytezyme의 효용성 연구 이상의 근거를 계기로 하여, [가축에서의 발아곡물유래 복합효소제의 활용성과 특히, 사료내 함유된 유기태 인의 이용성 증대와 무기태인 인 첨가 사용을 감소함으로써 환경오염을 최소화하는 것을 목표로 한 연구]가 국책 연구 과제로 채택되어(1997~1999), 발아곡물의 여러가지 특성을 실험실내 실험과, 실제 축산현장에서의 적용 시험을 통해 가축에서의 효용성을 각각의 가축별 전공 교수들에게 의뢰하여 축종별 사양실험을 통해서 확인 하였다.