Moderní způsoby kultivace

1. Ing. Aleš Prell, CSc. Mikrobiologický ústav AVČR, v.v.i. Biotechnologická hala Moderní způsoby kultivace

2. kultivace v bioreaktorech submerzní kultivace v kapalině (SLC) míchané bioreaktory jednorázové kultivační vaky membránové bioreaktory kultivace na pevných půdách (SSC) proces – dynamika, řízení, optimalizace základní typy kultivačních procesů optimalizace bioprocesu moderní způsoby kultivace v bioreaktorech

3. kultivace v bioreaktorech

4. BIOREAKTOR zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze substrátu na jeden či více produktů

5. ideální bioreaktor rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace, nízké provozní náklady

6. transport živin a metabolitů • mezifázové rozhraní plyn-kapalina • transport v kapalině • kapalina-pevná fáze • transport aglomerátem • transport přes biologické membrány Sj - substráty, Pj - produkty, ∆Hv - tepelná bilance

7. rozdělení bioreaktorů / kultivací

8. podle skupenské fáze • submerzní (suspenzní) – částice se volně vznášejí v kapalné fázi • míchané reaktory • air-lift • bublané kolony • imobilizované – buňky jsou ukotveny v pevné struktuře • membránové – oddělení fází či komponent systému • pevné lože (packed-bed) – protékání pevného nosiče • fluidní lože – vznáší se v proudu • na pevné fázi – médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a buňky tvoří povlak čí nárůst

9. submerzní kultivace (Solid-Liquid-Cultivation – SLC) vs. kultivace s imobilizací vs. kultivace na pevném substrátu (Solid-Solid-Cultivation – SSC)

11. rozdělení bioreaktorů podle • operačního módu • vsádkový (batch) • přítokovaný (fed-batch) • kontinuální • perfuzní • měřítka • laboratorní (do 30 L) • čtvrtprovozní (do 100 L) • poloprovozní (do 5000 L) • provozní

12. minimalizace odparu kapaliny tlaková odolnost sterilita operace čištění bioreaktoru bezpečnost účelová flexibilita a kompatibilita cena zařízení a jeho provozu přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up výběr bioreaktoru • přestup kyslíku • přestup tepla • přestup hmoty • požadavky na míchání • nároky na energie • citlivost kultury ke střižným silám • reologie kapaliny - viskozita média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střižné síly)

13. živné půdy (media)

14. kultivační médium • je nezbytné pro růst a metabolismus mikroorganismů • tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje chování mikroorganismu (růst, metabolismus, fyziologie) • ovlivňuje výtěžnost, rychlost tvorby produktu, složení produktu • musí obsahovat dostatečné množství živin • živiny – růst buněk, získání energie pro syntézu produktu a zachování buněčné integrity

15. DEFINOVANÁ známo složení minerální soli čisté esenciální složky zdroj uhlíku a energie základní typy médií • KOMPLEXNÍ • organický zdroj živin • hydrolyzáty proteinů (peptony) • extrakty masa, kvasnic

16. návrh složení média • je nutno znát biochemii kultivace – vliv na metabolismus a fyziologii buněčné populace • účel kultivace – složení média (DSP) • cena (tvoří přes 50% ceny konečného produktu), stálost jeho složení • formulace média - kompromis mezi nutričními požadavky, cenou a dostupností složek média • chemické složení média – určí se ze složení biomasy a produktu, výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů

17. funkce živin • zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu nových buněčných součástí – sloučeniny, které se stanou součástí biomasy • zdroj energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouží k výrobě energie (jako donory nebo akceptory elektronů) • ovlivňují složení mikrobiální buňky • elementární složení všech mikrobiálních buněk je relativně podobné – možnost odhadu obecných požadavků MO na živiny a návrh média – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P)

18. fyziologické funkce média • uhlík, vodík, kyslík, dusík, fosfor, síra, kationty a stopové prvky, voda... • část oxidována na CO2 (disimilace), využití takto získané energie na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace) • poměr asimilované a disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje • maximální výtěžnost substrátu - čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí se to v YX / S

19. hlavní elementární složky • VODÍK – hlavní zdroj je katabolický NAPDPH+ • KYSLÍK – plynný, mění typy metabolismu • DUSÍK – amonné soli, dusičnany, aminokyseliny, močovina, pepton, hydrolyzát kaseinu, kvasničný extrakt • FOSFOR – anorganické fosfáty • IONTY KOVŮ – Fe, Mg, K, Ca... • definované roztoky nebo komplexní org. zdroje

20. další nezbytné složky • stopové prvky – Na, Mn, Co, Ni, Cu • růstové faktory - esenciální org. sloučeniny, které si buňka neumí sama syntetizovat • vitamíny – často kofaktory enzymů • L-aminokyseliny – především glutamová • puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových kyselin • VODA – pitná, deionizovaná, destilovaná... • odpěňovadla – povrchové napětí, oleje, polyglykoly polymery (PPG)

21. pH a iontová rovnováha • stabilizace pH – užití pufrů v médiích • organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES … • regulace pH • NaOH, NH3, H3PO4, H2SO4 • iontová síla, redox – ovlivňují růst, produkci a produkty

22. příprava inokula, sterilizace, inokulace

23. příprava inokula • uchování kmenů • lyofilizace, tekutý dusík, hluboké zmrazení • přeočkovávání na pevných půdách • revitalizace v kapalném médiu – třepání • inokulační tanky • poměr 1:10 až 1:20 • důraz na růst, nikoli produkci, často komplexní média a převod do definovaných • co nejméně inokulačních stupňů

24. aseptický proces, sterilizace

25. požadavky na aseptický proces • sterilita – nepřítomnost živých organismů • odstranění veškerých živých MO ze zařízení • zabránění vstupu kontaminace po sterilaci • zachování sterility – ekonomika procesu, bezpečnostní hledisko • sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího zařízení a portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací zařízení, senzory atd.)

26. úrovně požadavků na čistotu • pro dekontaminace životního prostředí • pro agrotechnologie • pro krmivářství • potravinářská kvalita • pro biochemii, biotransformace • farmaceutická a medicínská kvalita

27. kontaminace může způsobit • likvidaci producenta (bakteriofágy) • produkci toxinů (bezpečnost produktu, inhibice produkčního kmene) • produkci enzymů (degradace produktu) • snížení výtěžnosti (spotřeba substrátu) • produkci metabolitů (polysacharidy) • spotřebu části substrátu (výtěžnost)

28. sterilizace média a bioreaktoru • ostrou párou min 121ºC, 0.2 MPa • horkým vzduchem 150-180ºC • chemicky – ethanol, chlornan sodný, fenol, formaldehyd.... • UV, X-rays – většinou povrchy, prostory • ultrafiltrace – plyny, roztoky • velké bioreaktory in situ (SIP), malé v autoklávu

29. hodnocení sterility • D-hodnota – snížení počtu zárodků na 1/10 • závisí na odolnosti mikroorganismu • N – počet živých zárodků, t – čas sterilizace, k - konstanta MO pro mokré/suché teplo • Bacillus subtilisD121 = 0.4 - 0.7 min (mokré teplo) • pro N0/Nt = 1012 je t = 12.D

30. sterilizace parou in situ • naplnění médiem, zapnutí přívodu páry, míchání pomalé, horní otvor otevřen, ostatní uzavřeny, zahřátí média, vypuzení vzduchu, dosažení 100ºC • uzavření horního otvoru, jediná cesta – kondenzátor, sterilace filtrů (in/out), sterilace potrubí a výpustního ventilu, dosažení 121ºC, sterilace 20 minut • ochlazení na kultivační teplotu • nutnost sterilního vzorkování a filtrace vzduchu

31. sterilizace vzduchu a odplynů • možnost sterilizace velkých objemových průtoků: • vzdušnění obvykle 1 VVM • 10 m3 reaktor – za 48 h 29 000 m3 vzduchu • koncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchu • ultrafiltrace – splňuje všechny požadavky, používá se ke sterilizaci vzduchu, hydrofobní membránové filtry vpatroně, póry 0.1 μm

32. inokulace • aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně • sterilizovatelné potrubní spojení • čerpání tlakem sterilního vzduchu • sterilní inokulační jehly • septa v aperturách ve víku bioreaktoru • čerpání peristaltickými čerpadly • inokulum nepřichází do styku s čerpadlem

33. přestup tepla, aerace a přestup kyslíku

34. přestup tepla • vznik tepla - míchání (příkon míchadla 15 kJ/m3.s, aerace, činnost mikroorganismů • aerobní procesy – množství uvolněného tepla proporcionální spotřebovanému kyslíku, • Q(kJ/m3.s) = 0,12 . OCR(mmol O2/m3.s) • Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost spotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol utilizovaného O2 • submerzní kultury 3-15 kJ/m3.s • odvod tepla – chlazení, externí plášť, interní vestavby • scale-up – přestup kyslíku a tepla limitující (omezená chladicí plocha – vyšší objem, menší chladicí plocha)

35. aerace (provzdušňování) • aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za současné účinné dispergace – velké mezifázové rozhraní • stupeň dispergace • Db – průměr bublin (2-3 mm), ε – plynová zádrž • vvm – volume/volume/minute • VG – průtok vzduchu • Vr – objem reaktoru

36. přestup kyslíku • rychlost přestupu kyslíku (oxygen transfer rate) • rychlost spotřeby kyslíku (oxygen uptake rate)

37. vlivy na přestup kyslíku • C*: rovnovážná koncentrace kyslíku • teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, viskozita) • C: aktuální koncentrace kyslíku • geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a velikost míchadla, příkon, zarážky • aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu, způsob operace • vlastnosti kapaliny (morfologie a koncentrace MO, odpěňovací činidla) ovlivňují C • velké fermentory (>5000 L) OTR < 300 mmol/L.h

38. jak zvýšit přestup kyslíkuza daných podmínek • zvýšení průtoku vzduchu • zvýšení otáček míchadla • zvýšení tlaku v bioreaktoru • zvýšení obsahu kyslíku ve vzduchu • závislosti jsou nelineární

39. submerzní kultivace v kapalném médiu SLC

40. submerzní bioreaktory • kyslík - aerobní, anaerobní • konstrukce • míchání - mechanické, pneumatické nebo hydraulické • fluidní vrstva • náplňové • membránové • fotobioreaktory • ...........

41. hlavní funkce bioreaktoru • zajistit ideální prostředí pro růst a tvorbu produktu • médium → živiny → homogenita →míchání • médium → živiny → přítokování • aerobní procesy → přestup kyslíku → míchání, aerace • tepelná bilance → míchání, temperace • regulace pH

42. míchané bioreaktory

43. míchání bioreaktoru • s mechanickým mícháním • s pneumatickým promícháváním • probublávané reaktory • prosté • s vnitřními vestavbami (air-lift) • s cirkulační trubkou • s vnější cirkulací • fluidní lože

44. pneumaticky míchané reaktory • vstup energie pouze plynnou fází (aeračním plynem) • vzduch vstupuje zespoda tryskami • aerobní kultivace • vhodné pro MO citlivé ke střižným silám • výhody: jednoduché zařízení, neporuchové, investičně nenáročné, rychlost přenosu kyslíku vysoká • nevýhody: ne pro média s vyšší viskozitou, velká spotřeba vzduchu, pěnění média

45. probublávané reaktory • cylindrická nádoba, poměr 1:2 (kolona) • rozdělovač plynu obvykle naspodu reaktoru • nepřítomnost speciálních difuzorů a vestaveb • přestup kyslíku a míchání – dáno rychlostí proudění vzduchu a reologií kapaliny • maximální rychlost míchání obvykle ≤ 0,1 ms-1 • nevýhoda – obvykle malý přestup O2

46. air-lift reaktory • vestavby – zarážka, cirkulační trubka • funkce vestaveb: • dostatečná dispergace plynu – umožňuje obnovování mezifázového povrchu – zvyšuje přestup kyslíku • organizování toku fází • zvýšení doby prodlení plynu • zvýšení mikroturbulence

47. air-lift reaktory - cirkulace • systémy s vnitřní cirkulací • difuzor pod cirkulační trubkou, vzestupné proudění v trubce, část odplynů odchod horní částí, v mezikruhové ploše proudí kapalina zpět dolů • cirkulační trubka • systémy s vnější cirkulací • 2 kolony spojené ve spodní a horní části • aerovaná kolona – větší průměr • úplná separace bublin z kapaliny v horní části reaktoru • indukovaná cirkulace směruje vzduch a kapalinu v reaktoru

48. bublaná kolona aair-lift s centrální trubkou

49. reaktory s fluidním ložem I • vhodné pro imobilizované MO nebo enzymy, flokulované MO • kapalina proudí vzhůru – suspendace pevné fáze • podobné probublávaným reaktorům, horní část rozšířená – redukce povrchové rychlosti – pevné • částice se vracejí do střední části, kapalina odchází • lze probublávat vzduchem/jiným plynem – zvýšení turbulence a míchání • příliš lehké částice – použití nosiče, zvýšení sedimentační schopnosti • náplňové bioreaktory • pevná matrice (porézní x neporézní, polymer x rigidní materiál), biokatalyzátor

50. reaktory s fluidním ložem II • přívod živin, kontinuální, proudí přes náplň, metabolity a produkty odváděny • výška náplně – hustota a kompresibilita nosiče, proudění kapalin (tlak na nosič), prostor pro proudění plynů • nehomogenní prostředí – změna koncentrace živin s výškou náplně, gradient pH, špatné promíchávání • využití – reakce, kde se vyskytuje inhibice produktem (rozdílná koncentrace produktu podél náplně)