Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos

1. Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los Protozoarios Parásitos

2. Nutrición • Dependencia metabólica del hospedero • Capacidad biosintética limitada • Conocimiento derivado de cultivos y en pocas especies • Single omission tests: difícil sacar conclusiones • Sustancias nutritivas universales: HC, aa, vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas

3. Nutrición - Mecanismos • Difusión simple: moléculas apolares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas • Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad • Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración • Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis

4. Glúcidos • Transporte mediado en membranas celulares • T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b) fructosa y glucosamina • T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de glicerol • E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso limitante • Plasmodium: modulación de la membrana de la célula huésped (eritrocito) con poros.

5. Caso: Metabolismo de Galactosa en T. brucei. • El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de T. brucei. • Gal está presente en cantidades importantes en las VSG • Los transportadores de hexosas de T. brucei son incapaces de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP-glucosa 4´epimerasa (galE).

6. Generación de mutante condicional para galE • Línea celular knock-out condicional (cKO) conteniendo una copia ectópica de galE inducible por Tetraciclina y ambas copias alélicas del gen reemplazadas con genes resistentes al antibiótico. • En presencia de Tetraciclina (+Tet) las células cKO expresan suficiente galE para crecer normalmente. • En (–Tet) se detiene la división en 3-4 días seguida de muerte celular.

7. Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T. brucei y contenido de nucleótidos • Growth of galE-cKO with and without Tet • (B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the galE-cKO Tet • (C) Sugar nucleotide levels of the galE-cKO Tet cells. • Los niveles celulares de UDP-galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.

8. Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina

9. Mutante condicional null para galE • Bajo condiciones no permisivas que induce la deprivación de Gal. • Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de galE • Después de 96h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar. Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.

10. Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol

11. Aminoácidos • Translocación – mediada en su gran mayoría • Endocitosis de proteínas. • T. brucei: 4 sitios operativos • T. cruzi: Arg altamente específico, con 3 sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala • Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma

12. Caso: la Arginina es un aa esencial para Toxoplasma gondii • En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato • T. gondii carece del gen de la CPSI • Deprivación de Arg bloquea multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.

13. Síntesis de la Arginina

14. Deprivación de Arg dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos Verde: proteína expresada por taquizoítos Rojo: proteína expresada por bradizoítos Azul: núcleos teñidos con DAPI A: 48hs medio normal B: 48hs medio sin Arg C: 7 d sin Arg D: 14 d sin Arg E: Contraste de fase de D F: Cepa PLK 4 d sin Arg

15. La deprivación de Arg produce una detención del crecimiento en taquizoítos de T. gondii que es rescatada por citrulina pero no por ornitina

16. Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium

17. Hemoglobina • 95% de las proteínas totales de GR • Abundante (>300 mg/ml o aprox 5 mM) • 60-80% es degradada durante el estadio eritrocitario • 110 g (en un total de 750) se consume en 48 hs con una parasitemia del 20%

18. Erythrocytic Shizogonic Cycle • Los merozoítos interactúan con la membrana del GR e invaden activamente la célula formando una vaculoa parasitófora Merozoíto entrando un GR Trofozoíto en GR

19. Endocitosis del citoplasma eritrocitario cytostome food vacuole pinocytosis (rings)

20. Vacuola DigestivaUn lisosoma especializado ATP Digestión de Hb H+ (pH 5-5.4) ADP • Proteases de la vacuola • plasmepsinas I & II (acid) • falcipainas I - III (tiol) • falcilysinas (metallo) Camino endocítico citoplasma parasitario

21. El clivaje inicial de las plasmepsina es específico y desestabiliza la Hb • Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadena α) • ‘región bisagra’ • conservada • Importante para la estabilidad del tetrámero • Se disocian grandes fragmentos de globina • Se libera el grupo Hem • Los fragmentos de globina son susceptibles de posterior hidrólisis a-F33/L34 í

22. hemoglobina plasmepsina fragmentos grandes de globinas heme + falcipaina plasmepsina Fragmentos pequeños (6-8 aa) Fragmentos medianos (20 aa) falcilysina La digestion de Hb es un proceso ordenado • exopeptidasas • aa libres?

23. El Heme libre es tóxico • Destabiliza and lisa membranas • Hidrolasas liberadas al citoplasma del parásito que muere • Posibles Mecanismos de Detoxificación • heme  hemozoína (pigmento malárico) • Degradación mediada por H2O2 • Degradación mediada por GSH • heme oxygenasa (P.b. and P.k.)

24. Hemozoína = b-Hematina b-hematin heme

25. b-hematina forma cristales insolubles 'biocristalización' o 'biomineralización'

26. Nucleótidos • No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo • Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos • En kinetoplástidos Adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina • Locus para transporte de nucleósidos • Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie • Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina

27. Vías de salvataje de purinas en parásitos

28. Lípidos • Transportadores para AG • Difusión pasiva para AG no disociados • Apicomplexa: transporte a través de vacuola parasitófora • Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria • Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto

29. Metabolismo del colesterol en Toxoplasma gondii

30. METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS Generalidades Objetivos del metabolismo energético • a)   Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía • b)   Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas

31. KINETOPLASTIDOS • Trypanosoma brucei como modelo: • a)     Depende únicamente de glicólisis para producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol • b)    Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR • c)     Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma • d)    Flujo glicolítico es relativamente alto • e)     Enzimas glicosómicas no glicolíticas deprimidas

32. Glicólisis • Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200. • Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas. Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O2 dentro de la mitocondria • Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa. • Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma. • Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO2, ALA y ASP

33. Glicólisis y glicosomas

36. Amebas Intestinales y Giardia • Glicólisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol • Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa • Sin citocromos • Almacenan glucógeno • Toleran bajas concentraciones de oxígeno

37. Figure 2Nucleoside phosphate and pyrophosphate metabolism in the glycolytic pathway of the eukaryotic anaerobic amoeba, Entamoeba histolytica. (A) The glycolytic pathway of E. histolytica. (B) PPDK uses PEP and PPi to catalyze the conversion of AMP to ATP (i.e., the production of two high-energy phosphoanhydride bonds equals two "ATP equivalents"). (C) The ATP and PPi "balance sheet" for E. histolytica glycolysis. Abbreviations are as follows: 1,3-DPGA, 1,3-diphosphoglycerate; Fru-1,6-P2, fructose-1,6-bisphosphate; Fru-6-P, fructose-6-phosphate; Glu-6-P; glucose-6-phosphate; 3-PGA, 3-phosphoglycerate; PEP, phosphoenolpyruvate; PPDK, pyruvate orthophosphate dikinase; and PPi-PFK, PPi-dependent phosphofructokinase

38. Enzimas glicolíticas de Entamoeba histolytica

39. Trichomonas • Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO2 y H2O • La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones • La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H+ es el aceptor final de los electrones

40. Hidrogenosoma • Generación de ATP por compartimentalización del metabolismo fermentativo del piruvato con producción de Hidrógeno molecular • 1. Piruvato (de la glicólisis o por conversión del malato) es descarboxilado por la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa para formar AcetilCoA • 2. Los e- son transferidos desde la oxidorreductasa hasta la ferredoxina (Fe-S) y luego a protones para formar H2 catalizdo por la hidrogenasa. • 3. Acetil-CoA es convertida a acetato con la conversión concomitante de succinato a Succinil-CoA por la succinil-CoA sintetasa. • 4. La generación de succinyl-CoA está acoplada a la producción de ATP via fosforilación a nivel de substrato

41. CO2 hsp70 Protein import ME Malate Pyruvate cpn60 Transit peptides AAC NAD(P)H NAD(P)+ ATP N ADP NAD(P)-FO [Fe]Hyd H2 2Fd 2Fd- 2H+ ASCT Acetate Acetyl-CoA PFO Succinate Succinyl-CoA CO2 Double membrane CoASH STK Fungi and Trichomonas ADP + Pi ATP Enzyme found also in mitochondria Alpha-proteobacterial ancestry Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993) Unknown ancestry