VIRUS A DNA

1. VIRUS A DNA 1) DNA lineare .a DNAds = Adenovirus e Herpesvirus. Poxvirus .b DNAss = Parvovirus 2) DNAds circolare = Hepadnavirus, Poliomavirus e Papillomavirus Replicazione nucleare Replicazione citoplasmatica POXVIRUS Replicazione nucleare e citoplasmatica HEPADNAVIRUS

2. > velocità > errori REPLICAZIONE del DNA VIRALE SEMICONSERVATIVA Parvovirus - Papillomavirus e Poliomavirus: DNA pol cellulare Adenovirus - Herpesvirus: DNA pol virale Target per agenti antivirali (es. acyclovir, AZT)

3. REPLICAZIONE DEI VIRUS a DNA • PROBLEMI • Richiesta di un primer di inizio della replicazione del DNA lo stesso problema della cellula ospite: le DNA polimerasi non sono in grado di replicare il DNA a partire da uno stampo a ssDNA. Possono solo iniziare la replicazione a partire da regioni ds (5’  3’) • come replicare le estremità senza perdere informazione? • soluzione: specifiche caratteristiche strutturali dei genomi

4. Le sequenze Ori siti di legame per proteine (Ori recognition proteins): Palindromi sequenze dentro o vicino a regioni di controllo trascrizionale siti di legame perfattori trascrizionali e proteine con funzione di enhancer , virali e/o cellulari (aumento dell’efficienza di replicazione) sequenze ricche di AT: facilitano lo srotolamentote From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

5. Replicazione del genoma dei virus a DNA : le proteine di riconoscimento della regione ORI Tutti i virus a DNA devono codificare almeno una proteina per iniziare la replicazione del genoma I virus più grandi codificano anche la loro DNA polimerasi e altre proteine essenziali per la replicazione del genoma Caratteristiche comuni: legame di specifiche proteine alla regione ORI del genoma virale. il legame con le proteine tende a distorcere la regione ORI Molte delle proteine reclutate sulla regione ORI hanno attività di elicasi ATP-dipendente per lo srotolamento del DNA virale eventuale reclutamento di proteine cellulari per la replicazione del DNA virale From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

6. Trascrizione di geni su filamenti diversi di DNA ed • in direzione opposta (es. SV40 = early e late su filamenti opposti) TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA Presenza di proteine regolatrici virali e/o cellulari che interagiscono con sequenze “promoter”al 5’ dei geni virali Utilizzano RNA pol II cellulare 5’ sequenze “cap” 3’ poli A (100-200 residui di adenina) • mRNA policistronici • lettura in ORF differenti • mRNA con introni • Splicing

7. TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA nel nucleo della cellula ospite ecc: Poxvirus: Utilizzano enzimi presenti nel core del virione Trascritti senza introni. Assenza di splicing -Organizzazione temporale (in 2 tempi) con: Proteine non-strutturali mRNA precoci Replicazione del DNA Proteine strutturali mRNA tardivi

8. TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA -Organizzazione temporale (in 3 tempi) con: immediati precoci(CHX insensibili) Precoci ritardati (CHX sensibili) mRNA precoci Replicazione del DNA mRNA tardivi Proteine strutturali Es. HERPESVIRUS

9. SV40 POLYOMAVIRIDAE (45 nm) Capside icosaedrico nudo VP1, VP2 e VP3 DNA ds circolare (5.2 kbp) legato a istoni cellulari (H2A, H2B, H3 e H4) mRNA E e L trascritti in modo divergente a partire da ORI Espressione temporale geni precoci replicazione DNA geni tardivi

10. precoci: proteine T e t ( regolatorie e multifunzionali) Proteine di SV40 - regolano la loro stessa sintesi transizione della trascrizione da precoce a tardiva - attivano l’espressione dei geni tardivi - essenziale per la replicazionedel DNA virale • interazione con pRB e p53 (induzione della fase S nella cellula ospite ed inibizione dell’apoptosi cellulare tardive: proteine strutturali (VP1, VP2, VP3)

11. sito di origine della replicazione (ORI) la replicazione del DNA è bidirezionale (replicazione a Theta) Replicazione del Genoma di SV40 2 esameri di proteina T legano un sito (sito II) della ORI • ORI = sequenza unica proteina T (elicasi) insieme a RpA cellulare (proteina di legame ssDNA) srotolano il DNA in modo da permettere la sintesi bidirezionale del DNA • Terminazione della sintesi del DNA a 180o da ORI ( congiunzione delle forche di replicazione)

12. PAPILLOMAVIRIDAE (55 nm) Capside icosaedrico nudo (L1,L2) DNA ds circolare (8 kbp) legato a istoni cellulari >100 tipi di HPV (Human Papilloma Virus) alto rischio: HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-45 Specie-specifici Tropismo per cellule dell’epitelio squamoso Infezione produttiva solo in cellule epiteliali differenziate

13. PAPILLOMAVIRUS 2 geni L ( L1 e L2 strutturali) 7 geni E E6 si lega a p53 : segnale per ubiquitina e degradazione E7 attiva la proteina Rb

14. I PAPILLOMAVIRUS: il ciclo virale

15. Proteine Virali • E2: fattore regolatore della trascrizione e della replicazione del DNA virale. • E1: fattore importante per la replicazione del DNA virale, si lega all’origine di replicazione posto nel LCR • E4: e’ espressa come gene late. Overlaps E2, ma ha un differente ORF. Viene sintetizzata contemporaneamente alla relicazione del DNA, prima della sintesi di L1 ed L2 • E5: è altamente idrofobica, associata a membrane cellulari. Sembra induca una down regulation del sistema MHC • E6: oncogene virale, interagisce con p53 • E7: oncogene virale, interagisce con pRb

16. ADENOVIRIDAE isolati da adenoidi umane - 1953 Capside icosaedrico nudo 60-90 nm Circa 100 sierotipi umani Infezioni respiratorie ed enteriche Congiuntiviti acute infezioni latenti nel tessuto linfatico di tonsille, adenoidi e placche del Peyer (alcuni tipi oncogeni per roditori neonati)

17. ADENOVIRUS Terminal protein P55 5’ desossicitosina Genoma: dsDNA lineare (30-35 Kbp) ITR ITR = Inverted Terminal Repeat ITR

18. ADENOVIRUS Espressione del genoma Geni precoci = E1a, E1b, E2a, E2b (DNA pol), E3, E4 Geni tardivi = L1, L2, L3, L4, L5 (proteine strutturali)

19. 1. la Polimerasi virale forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP il legame di Nf-1 e Oct-1 alla sequenza core Ori facilita la formazione del complesso 2. il 3’OH di dCMP serve da innesco per la sintesi (in continuo) del filamento di DNA complementare Ad ssDBP (E2), e Topoisomerasi 3. l’elica di DNA dislocata forma un “panhandle” via gli “inverted terminal repeats” Adenovirus: replicazione del DNA lineare la PROTEINA TERMINALE funge da PRIMER 4.associazione Pol-pre-TP e …… 5. sintesi (in continuo) del filamento complementare From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

20. HERPESVIRIDAE Sottofamiglia Genere Tipo Herpes simplex virus tipo 1 Simplexvirus Alphaherpesvirinae Herpes simplex virus tipo 2 Varicellovirus Virus Varicella Zoster 150 nm Cytomegalovirus Citomegalovirus Betaherpesvirinae Herpesvirus umano 6 Roseolovirus Capside icosaedrico con involucro Herpesvirus umano 7 Epstein Barr Gammaherpesvirinae Lymphocrypto- virus virus Herpesvirus umano 8 Rhadinovirus o del sarcoma di Kaposi

21. Genoma di HSV-1 DNAds lineare (150 Kb) Sequenze Uniche = U (L e S) Sequenze Ripetute = R (L e S), (T e I)

22. Genoma del virus Herpes Simplex di Tipo 1 Il genoma lineare quando entra del nucleo della cellula ospite circolarizza per la presenza di sequenze presenti alle due estremità TR Il genoma viene trascritto ad opera della RNA polimerasi II cellulare

23. HSV-1:REPLICAZIONE DEL GENOMA proteine b necessarie per la sintesi del DNA virale ORI binding protein (UL9) helicase/primase complex (UL5, UL8, UL52). DNA polymerase (UL30), DNA binding proteins (UL42, UL29, ICP8)

24. 1. taglio della molecola circolare : 3’-OH utilizzato come primer Modello di replicazione del DNA dei virus erpetici Cerchio rotante 2. la sintesi della nuova elica provoca la dislocazione dell’elica complementare 3 e 4. sintesi in continuo della forma circolare e sintesi discontinua sull’elica dislocata con formazione di concatameri di dsDNA Il taglio del DNA (sequenza terminale ripetuta a) congiuntamente al processo di incapsidamento del DNA genera i nuovi genomi virali lineari From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

25. CICLO DI REPLICAZIONE cascata di espressione genica assemblaggio e maturazione

26. 1 molecola lineare DNAss 4.5 - 6 Kb : PARVOVIRIDAE Capside icosaedrico non-rivestito 18-28 nm Parvovirus autonomi Dependovirus o Virus adeno-associati (AAV)

27. Adeno-associati AAV Ad Virus satelliti: Per replicare richiedono attiva replicazione cellulare o la co-infezione con un virus helper (adenovirus o herpesvirus)

28. DNA lineare ss (4.5 - 6 Kb) PARVOVIRUS: Sequenze terminali 115nt 115nt Sequenze terminali palindromiche filamento codificante: filamento(-)

29. PARVOVIRUS Regioni separate per:proteine non strutturali (gene NS1, gene rep) proteine strutturali (geni cap)

30. REPLICAZIONE DEL GENOMA DEI PARVOVIRUS REP78 reazione nicking necessaria per la risoluzione dei terminali. attività di elicasi essenziale per srotolamento della regione ITR rolling hairpin model +