实验十　大肠杆菌（ E.coil ）梯度转移基因定位（非中断杂交）（一）

实验十　大肠杆菌（E.coil）梯度转移基因定位（非中断杂交）实验十　大肠杆菌（E.coil）梯度转移基因定位（非中断杂交）（一）一、目的：熟悉细菌接合和基因定位分析的原理；掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术；理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键技术点。

二、内容： 母液配制，培养基培制，器具干热、湿热灭菌。活化菌种，接种，扩菌，杂交，涂平板，培养，点种A，点种B-G。实验结果观察统计分析，基因位点距离计算。

配对区 致育基因区大肠杆菌菌株： 1）F - 菌株 2） F + 菌株 3）高频重组菌株（Hfr）复制区 “雌性” 原点 “雄性” 二、实验原理： F因子： DNA小环，占染色体DNA的2% 。

Hfr菌株×F-菌株： Hfr染色体从原点断裂，染色体向Fˉ菌株起始转移。杂交时间：全部染色体进入Fˉ需要100min。

杂交： F-菌株 × Hfr菌株 F-菌株 × F+菌株 F+菌株 F-不同类型的重组子菌株

随机中断：各种条件影响→转移随机中断。 完整染色体进入Fˉ细菌的机会很少，完整的F因子转移机会也很低。导致： 1）Hfr菌株与F-菌株的杂交一般不会使Fˉ变成Hfr 或F+。 2）Hfr染色体上的基因呈梯度转移: a b a c b a d c b a

杂交基因定位 非中断杂交（interrupted matting）基因定位：自然中断重组的百分率为指标中断杂交（non-interrupted matting）基因定位：人为中断接合供体基因在受体中的出现时间为指标后者比前者操作复杂两种方法测定两个紧密连锁基因时精度较差（以传统重组作图更好）。

三、实验材料： Hfr品系：CSH60 Strs，其余性状为野生型（供体） F-品系：CSH57 Strr，多重生化缺陷型：（met、lue、 trp、his、ade or pur、arg、lac、gal）（受体）杂交 Fˉ接受Hfr不同长度染色体→重组→各种重组子

F-品系（受体）： CSH57 Strr ，多重生化缺陷型不能合成 met、lue、 trp、his、ade or pur、arg 不能利用 lac、gal

如何选出各种重组子，排除供（父）、受（本）体？如何选出各种重组子，排除供（父）、受（本）体？选择性标记(selected marker)基因：目的：选择出全部的重组子，排除杂交中的受体菌。选什么样的基因？措施：培养基中不加Met和Leu。 Met和离Leu离原点最近反选择性标记(nonselected marker)基因：目的：排除供体菌，同时保证全部的重组子存活。选什么样的基因？措施：在培养基中添加链霉素(Str)。 Str离原点最远，使Hfr染色体更多机会进入受体

本实验所配制的选择培养基： A培养基：排除供、受体选择全部重组子 B~G培养基：选择各种重组子求出重组频率确定基因连锁情况

各种选择性培养基 A BC D E F G ←---- 葡萄糖　--------------→ 乳糖半乳糖＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋添加物质碳源 10×A 琼脂粉水 MgSO4 硫胺素(盐酸噻胺，VB1) 精氨酸腺嘌呤色氨酸组氨酸链霉素

四、方法步骤： 重组子数目取决于接合细胞数，通常Hfr与Fˉ细胞数之比为1:10~20 。重组子的检出：影印法，单菌落点种法本次实验——单菌落点种法。

点B-G板 涂A板点A板供体CSH60 接合 37 °C 24~48h 扩菌 B 37 °C 振荡100‘ 37 °C 24~48h 37 °C 24~ 48h A 1环菌 A对照 37 °C 2~3h 接种 C 0.1ml A 1ml 点５０个单菌落 3个200μL LB LB A D 0.2 ml 37°C 10~12h 观察结果 A 1ml 4 ml 3个100μL E LB A LB 点５０个单菌落 0.1ml 1环菌 A F A对照 G 受体CSH57

第一部分工作：为杂交做准备——配制各类母液、培养基，包装，灭菌第一部分工作：为杂交做准备——配制各类母液、培养基，包装，灭菌配制各种选择性培养基的基本溶液 LB液体培养基各种选择性培养基的配制包装各种器皿、用具

（一）配制各种选择性培养基的基本溶液 试剂名称 10 ×A 葡萄糖乳糖半乳糖 MgSO4.7H2O 硫胺素精氨酸色氨酸组氨酸腺嘌呤配制量 500ml 200ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 溶液规格 (119页） 20% 20% 20% 0.25M 1mg/1ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 注：1)色氨酸(Trp)需在50-60℃水浴条件下溶解。 2)腺嘌呤（Ade）不溶于水，需先用1N（不要过浓过稀）HCl调成糊，逐滴加1NHCl直到溶，再补水定容。 3)链霉素(Str)受热易分解，所以不能加入培养基中一起灭菌，而应在倒平板前，用无菌水现配现用。

（二）配制LB液体培养基： 150ml ，分装：2瓶/组，5ml / 瓶，其余交给老师（三）每组包装灭菌：培养皿20个蓝、黄tip头各1盒，接合用的空三角瓶（100ml）1个牙签200支（20支左右一包）用50ml小三角瓶分装更正：教材p118“LB液”配制中，蒸馏水应为１０００mL

（五）配制各种选择性培养基（此为100mL培养基配方）（五）配制各种选择性培养基（此为100mL培养基配方）（每组需250ml）（每组各需30ml) A BC D E F G ←---- 葡萄糖　--------------→ 乳糖半乳糖＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　　＋　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　　＋　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　　　＋　　＋＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋添加物质碳源 10×A 琼脂粉水 MgSO4 硫胺素精氨酸腺嘌呤色氨酸组氨酸链霉素 2ml 10ml 2g 88ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml

配制方法： 1. 称取琼脂+水, 煮沸 2. 另取其它各成分于一小烧杯中，一同加入煮好的琼脂中。 3. 分装, 灭菌（8磅，112℃，20min）

各小组灭菌后需收齐的物品： A培养基 250 mL （分装2个250ml三角瓶） B-G培养基各30mL （装于6个100mL三角瓶） LB培养基 10mL （分装2个50mL三角瓶, 上交）空的100mL三角瓶（1个）牙签（200只）枪头（蓝、黄各1盒，）培养皿（20个）开始实验先请老师安排试剂配制分工。

实验十　大肠杆菌（ E.coil ）梯度转移基因定位（非中断杂交）（一）