1 / 26

Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140

Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbe.cas.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140. Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: zopakovaní základních principů a postupů. Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin. R CH COOH. R CH COO -.

beate
Télécharger la présentation

Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbe.cas.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140 Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: zopakovaní základních principů a postupů

  2. Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin R CH COOH R CH COO- NH2 NH3+ Aminokyseliny - amfionty Komerční - většinou hydrochloridy (NH3+Cl-) Amfolyty- sloučeniny schopné vystupovat jako kyseliny nebo jako zásady

  3. pH 4 - 8 → aminokyselin jako amfionty Proteiny – amfolyty - na povrchu molekuly několik desítek postranních řetězců AK schopných disociace

  4. R CH COO- NH3+ 1 pI = (pK1+ pK2) 2 pI amfolyty přijímají H+ amfolyty odštěpují H+ NH3+RCOOH NH2RCOO- Isoelektrický bod (pI) Isoelektrický bod - Hodnota pH, kdy výsledný náboj molekuly je roven nule pI proteinů: neutrální cca 5-6 kyselé cca 2-3 bazické cca 9-11

  5. Purifikace proteinů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství enzymu) Dostupnost a typ vstupního materiálu, stabilita a obsah izolovaného enzymu, nároky na čistotu preparátu počet purifikačních kroků – omezení ztrát, časová a finanční náročnost Žádná metoda není dokonalá – je třeba si ujasnit k jakému účelu má sloužit Typ purifikační metody a její parametry je třeba volit uváženě, abychom získali dobré výsledky. - záleží na typu analyzovaného vzorku, parametrech metody, velikosti souboru zpracovávaných vzorků... (klinická lab, potravinářská a environmentální analytika, výzkum)

  6. Metody • základní • rozpuštění • hrubé oddělení • speciální • izolace • stanovení převedení biomolekul do kapalné fáze homogenizace, desintegrace, filtrace, centrifugace chromatografické, elektroforetické, spektrofotometrické, enzymové, ... Metody obecně používané v biochemických laboratořích

  7. Volba separační metody Dělení látek podle rozdílných vlastností: molekulová hmotnost elektrické vlastnosti povrchové vlastnosti biochemická aktivita Metoda pokusu a omylu obvykle nedává optimální výsledky Metody používané v programu: purifikace - srážení, dialýza, chromatografie ionexová, hydrofobních interakcí, gelová, (chromatofokusace) kontrola stupně purifikace – celkové množství proteinu, enzymová aktivita, elektroforesa, výtěžnost, nabohacení

  8. protein (NH4)2SO4 zvýšení rozpustnosti (NH4)2SO4 snížení rozpustnosti Srážení (NH4)2SO4 - vysolování různé bílkoviny se sráží při různých koncentracích vsolování – snižování hydrofobních int. vysolování – ztráta hydratačního obalu Používá se v počátcích purifikace, kdy je koncentrace proteinu ještě vysoká (> 1mg/ml)

  9. Množství pevného síranu amonného (g), které je potřeba přidat k 1 litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech nasycení roztoku síranem amonným.

  10. Dialýza Difuse nízkomolekulárních látek přes membránu vyšší koncentrace → nižší koncentrace Použití: odstraňování (výměna) nízkomolekulárních látek (odsolování, výměna pufru) koncentrační gradient Membrány, dutá vlákna Membrány: deriváty celulosy, MWCO 100 Da → 1 000 kDa voda, pufr s nízkou iontovou silou elektrodialýza - urychlení pohybu nabitých iontů v el. poli odsolování – MWCO 10 (25) kDa

  11. Ionexová chromatografie Chromatografie na měničích iontů Ion Exchange Chromapography - IEC Princip: separace podle náboje Iontoměniče (ionexy - “ion exchangers”) - pevné látky, které jsou schopny vyměňovat ionty s kapalnými fázemi. Částice iontoměničů obsahují kovalentně vázané ionizovatelné skupiny. porézní materiály elektrostatické interakce –eluce změnou pH, iont. síly

  12. Ionex = nerozpustná matrice s kovalentně navázanými skupinami nesoucími náboj katex - výměna kationtů anex - výměna aniontů Na+, H+ Cl-, OH- Separace látek podle afinity k ionexu - velikost nábojů na povrchu molekuly, tvar molekuly Pevnost vazby - pH, iontová síla roztoku

  13. P- P+ Vliv pH na velikost náboje: pH: většina bílkovin má pI v rozmezí pH 5 - 6 a je stabilní obvykle v rozmezí pH 6 - 9 katex: pH 3 – 8(bazické proteiny) anex: pH 5 – 10 většinou vazba na anex Vliv iontové síly: vyšší iontová síla → slabší vazba na ionex

  14. Silné ionexy – jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH(sulfoskupiny, kvarterní aminoskupiny) Slabé ionexy – jejich ionizovatelnost je silně závislá na pH. Slabé ionexy jsou obvykle ionizované při pH 6 - 9, jinak ztrácejí náboj Funkční skupiny CM karboxymethyl- slabý katex SP sulfopropyl- silný katex S sulfomethyl- silný katex SHP sulfohydroxypropyl- silný katex DEAE diethylaminoethyl- slabý anex TEAE triethylaminoethyl- silný anex QAE kvarterní aminoethyl- silný anex Q kvarterní amin – silný anex TMAHP trimethylaminohydroxypropyl- silný anex

  15. Průtoková rychlost: závisí na: rozměrech kolony, velikosti a tvaru ionexových částic rychlost 3 - 10 ml.cm-2.min-1 (cca 5 cm/h) Eluce: vymytí změnou složení eluentu gradientová eluce gradient iontové síly - vzestupný směr gradient pH – směrem k pI příkrost gradientu (příkrý - menší naředění,nižší rozlišení) celkový objem eluentu – 10ti – 20ti násobek objemu náplně kolony

  16. Chromatografie s hydrofobní interakcí Hydrofobní interakce Makromolekuly - hydrofobní skupiny (na povrchu nebo zanořené v kapsách) Zcela hydrofobní materiály (polystyren) – vazba molekuly ireversibilní (denaturace) hydrofobní sorbenty – hydrofobní zóny ligandy: oktyl-, fenyl-, propyl-

  17. Síla vazby roste s: rostoucí iont silou (4M NaCl, 1M (NH4)2SO4, teplotou, nejsilnější interakce: pH – pI Síla vazby klesá v přítomnosti chaotropních iontů, alifatických alkoholů, hydrofobních molekul Desorpce: snížení iont. síly, záměna iontů s nižším vysolovacím efektem, snížení polarity, přidavek tenzidu Metoda silně závislá na experimentálních podmínkách.

  18. Gelová (permeační) chromatografie Gelová filtrace na principu molekulárního síta - molekuly se separují podle velikosti a tvaru v pórech gelu relat. nezávislá na složení mobilní fáze Frakcionace peptidů, oligosacharidů, nukleotidů, bílkovin, enzymů, virů, nukleových kys. malé molekuly – difuse do struktury gelu → pomalejší postup kolonou velké molekuly – volně protékají nesferické molekuly - chovají se jako by byly větší

  19. vzdálenost mezi separovanými zónami Rs = šířka zón Stupeň rozlišení: Rs> 1.2 Rozlišovací schopnost stoupá úměrně s druhou odmocninou délky sloupce Pro lepší rozlišení - delší kolony s menším průměrem (ale roste doba separace). → opakovaně aplikovat vzorek na kolonu nebo použít sérii kolon Aplikace vzorku: objem vzorku 1-5% objemu kolony, pro odsolení až 30% neúčinné dělení zředěných vzorků!!!

  20. Frakcionační rozsah gelu: Rozsah molekulových hmotností nebo velikostí molekul, v němž změna velikosti způsobí změnu elučního objemu. Sephadex G-25 1 – 5 kDa Sephadex G-100 4 – 150 kDa mez vyloučení- velikost největšího proteinu, který může penetrovat do pórů gelu molekuly penetrují do gelu bez zábran Ve → Vt molekuly nepronikají do gelu Ve → V0

  21. Často se překrývají, potom lépe použít gel s nižší vylučovací mezí, protože požadované látky budou z kolony eluovány dříve.

  22. Použití: orientační stanovení Mr, odsolování (Sephadex G-25, oddělení molekul do 5 kDa) purifikace, zakoncentrování (přídavkem suchého Sephadexu G-25) Výhody: šetrná metoda, není důležité složení eluentu, separace je nezávislá na koncentraci látky (lze separovat i vysoce konc. vzorky – ale nesmí být moc viskozní), teplotě levná, jednoduchá Omezení: nutné aplikovat malý objem vzorku (ca 1% Vt) – omezení vlivu difuse

  23. techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou

  24. Produkt jedné metody by měl být využit v další metodě.

  25. precipitace dialýza, gelová f. G-25 hydrofobní interakce ionexová chromatogr. (afinitní chromatogr.) (elektroforesa) zakoncentrování vzorku odstranění částečně zdenaturovaných nebo agregovaných artefaktů gelová filtrace obsah solí, pH – není důležité objem a koncentrace vzorku

  26. Obsah protokolu: 1. Číslo a charakteristika enzymu 2. U každého purifikačního kroku uvést zdůvodnění použité metody a nastavení jejích parametrů 3. U každého purifikačního kroku uvést výsledek – případné ztráty, výtěžnost (množství celkového proteinu a aktivity), nabohacení a efektivitu purifikace 4. Na závěr celý postup prezentovat formou tabulky 5. Závěr: Formulovat výsledek celého purifikačního procesu

More Related