1. RNA干扰 （RNA interference，RNAi） 007小组组长：方刚 组员：张科强 范宇巧 田甜 肖鹏 车斌

2. Contents RNAi的发现简史 RNAi的相关知识 RNAi的分子机制 RNAi的应用前景 RNAi的实验方法 1 2 3 4 5

3. 2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了“RNA（核糖核酸）干扰”机制。2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了“RNA（核糖核酸）干扰”机制。 诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”。公报指出，RNA干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。 法尔目前任职于美国麻省理工学院，梅洛目前在美国哈佛大学工作。他们将分享1000万瑞典克朗（约合140万美元）的奖金。

4. 梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。 法尔(AndrewFire)1959年出生在美国加利福尼亚州，本科在加利福尼亚大学伯克利分校主修数学，仅用3年时间就拿到学位。与梅洛类似，他逐渐对涉及生命奥秘的遗传学产生兴趣，并将其作为自己终身的学术追求。

5. 06年获奖时，梅洛46岁，法尔47岁，在历代诺贝尔奖获得者中，是年龄偏低的，而且他们从科学发现到获奖还不足１０年的时间，这在诺贝尔奖历史上还属罕见。诺贝尔生理学或医学奖评委在现场解析今年的获奖成果时说：这是诺贝尔奖首次不发给一个拥有答案的研究，相反，ＲＮＡ干扰机制为我们提出的是更多需要解答的问题，为基因技术研究提供了令人兴奋的可能性。06年获奖时，梅洛46岁，法尔47岁，在历代诺贝尔奖获得者中，是年龄偏低的，而且他们从科学发现到获奖还不足１０年的时间，这在诺贝尔奖历史上还属罕见。诺贝尔生理学或医学奖评委在现场解析今年的获奖成果时说：这是诺贝尔奖首次不发给一个拥有答案的研究，相反，ＲＮＡ干扰机制为我们提出的是更多需要解答的问题，为基因技术研究提供了令人兴奋的可能性。 这样一个让诺贝尔奖都为之破例的伟大发现，究竟经历了哪些历程，就这么快就被科学界承认了呢？ 下面就让我们来看看RNA干扰的发现简史。

6. 90年代初，美国和荷兰的两个转基因植物实验组Rich Jorgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。也就是说转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，Jorgensen将这种现象命名为共抑制(cosuppression) 一、RNA干扰的发现简史 94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制(quelling)。

7. 试验 预测 野生型 06年诺贝尔生理学或医学奖颁布后 来自英国剑桥大学生物技术学院，以及比利时法兰德斯大学校际生物科技研究所的三名科学家向英国著名的《Nature》杂志寄出的一封信中，表示了他们对于此次RNAi获得诺贝尔奖的遗憾之处——植物RNAi研究领域科学家没有能包括在这一奖项中 这足以说明，植物领域科学家们在RNAi发现和机制阐述方面做出的关键性作用 Rich Jorgensen

8. 1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。 论文： Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620. 一、RNA干扰的发现简史

9. 1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。该小组将这一现象称为RNA干扰。 论文： Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Nature. 1998,391:806-811. 一、RNA干扰的发现简史

10. 在1999年短短的一年间,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。在1999年短短的一年间,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。 2000年提出RNAi作用机制模型。 论文： Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296 Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-33 一、RNA干扰的发现简史 2001年，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。Nature，2001，411（6836）：494－498

11. 此后，RNA干扰技术迅速兴起并掀起了一股生物技术热潮，在2000～2003年间，连续4年被列入世界十大科技进步之一。Sciencee曾将RNAi评为2002年十大科技进步之首。麻省理工大学的生物学家，诺贝尔奖获得者菲利普 夏普认为，RNAi技术将成为十年来甚至几十年来最重要和激动人心的科学突破 一、RNA干扰的发现简史

12. 线虫体内的RNAi • 线虫中RNAi效应的检测 • （左面）两条线虫表现为绿色荧光蛋白（GFP）表达类型品系，该品系含有一个普遍性表达的GFP报告基因重组质粒（带有核内定位信号位点）。 • （右面）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体的GFP信号消失。

13. RNAi的定义 • 目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同 • 如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义 ① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的 特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水 平和翻译水平上阻断基因的表达。 ② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA 为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性 的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后， 细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基 因沉默的现象。

14. RNAi的定义 如果将其作为一门生物技术，则定义为： ③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 ① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 ② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。

15. 我们不惜花费这样的篇幅给同学们介绍RNAi的发现史，一来是希望同学们能了解这项伟大发现的来龙去脉，知道那些曾为此做出过贡献的科学家，二来也是希望能引起同学们对RNAi的兴趣。我们不惜花费这样的篇幅给同学们介绍RNAi的发现史，一来是希望同学们能了解这项伟大发现的来龙去脉，知道那些曾为此做出过贡献的科学家，二来也是希望能引起同学们对RNAi的兴趣。 接下来，我们将为同学们介绍的是RNAi的相关知识，例如前面所提到过的反义RNA和基因沉默等。这是同学们可能不太了解，但是对于理解RNAi的分子机制又必不可少的东西。

16. 基因沉默 RNAi的 相关知识 反义RNA DICER酶 SiRNA MicroRNA

17. 基因沉默（gene silencing） 基因沉默是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。 两种方式： TGS （transcriptional gene silencing） PTGS(post-transcriptional gene silencing) 在这两种水平上引起的基因沉默都与基因的同源性有关，称为同源依赖性的基因沉默。 (homology-dependent genesilencing,HDGS）。

18. 基因沉默（gene silencing）） 一方面，基因沉默是遗传修饰生物（genetically modified organisms）实用化和商品化的巨大障碍。 另一方面，基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应，为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略——RNA介导的病毒抗性。

19. 反义RNA 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子（也包括与其它RNA互补的RNA分子） 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。

20. 细胞中反义RNA的来源有两种途径∶ 第一是反向转录的产物，在多数情况下, 反义RNA是特定靶基因互补链反向转录产物, 即产生mRNA和反义RNA的DNA是同一区段的互补链。 第二种来源是不同基因产物，如OMPF基因是大肠杆菌的膜蛋白基因，与透性有关，其反义基因MICFZE则为另一基因。

21. 反义RNA的分类和作用机制 Ⅰ类:这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的编码区，引起翻译的直接抑制(ⅠA类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解(ⅠB类)。 Ⅱ类:这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚 Ⅲ类:这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。

22. dicer Dicer是RNaseIII家族中的一员,是特异识别双链RNA的核酸内切酶

23. 四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区

24. Small interfering RNA (siRNA) long dsRNA siRNAs 一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默，是 RNAi的主要效应分子

25. Small interfering RNA (siRNA)： siRNA有如下特点： 1. 长度约在22nt左右。 2. 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。 3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。 4. 是RISC组分。 5. siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。 6. siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。 7. 结构上， siRNA是双链RNA。 8. 在Dicer酶的加工过程中， siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。 9. 在作用位置上， siRNA可作用于mRNA的任何部位。 10. 在作用方式上， siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。 11. siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

26. 走进MicroRNA的大世界 MicroRNA也可以写做miRNA ，是一种21－25nt长的单链小分子RNA。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA。成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。

27. MicroRNAs:Expanding Family of ‘RiboRegulators’ 其碱基分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。

28. MiRNA的作用方式 以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译，但是不影响mRNA的稳定性，这种mRNA是目前发现的最多的种类。 以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式与siRNA相似，最后切割靶mRNA。 具有以上两种作用模式，当与靶基因完全结合时，切割mRNA，不完全互补结合时，起调节作用。

29. miRNA与近亲siRNA的差异 在描述两者的差异之前，有必要先说一说它们的共同点： 1． MiRNA和siRNA都是由22个左右的核苷组成； 2． 它们都是Dicer酶的产物； 3． 它们在起干扰、调节作用时都会和RISC诱导的沉默 复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合； 4． 它们都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译；

31. RNA干扰的分子机制: 关于这个问题，目前阐明的并不是很清楚，其中很多问题都还没有解决，但是大体模型已经建立。

32. How does RNAi work? RNAi works postranscriptionally…….. in key two steps!

33. step one: 34 27 21 20 16 short-interfering RNA processing the dsRNA into 21-23 nt fragments 第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。 Tuschl, 2001

34. 19 nt duplex 2 nt 3’ overhangs siRNAs have a defined structure siRNA的两条单链末端为5’-磷酸和3’-羟基，且3’端均有2-3个突出的核苷酸。

35. RNAi silencing complex • may be associated with translating ribosomes • active RNAse enzyme not yet identified • may participate in endogenous pathways that silence genes via translational repression 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。

36. step two: the antisense strand of the siRNA guides cleavage 活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。 Tuschl, 2002

37. 扩增和扩散阶段 siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。 新合成的长链dsRNA同样可被dicer切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。 Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.

39. 二、RNA干扰的机制 RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征： ①RNAi是转录后水平的基因沉默机制； ②RNAi具有很高的特异性； ③只有dsRNA才能诱导产生RNAi； ④只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰； ⑤注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解； ⑥RNAi抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；

40. 二、RNA干扰的机制 RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征： ⑦RNAi抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传给F1，但F2往往恢复为野生型。 ⑧dsRNA不得短于21个碱基，大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡； ⑨ RNAi作用迅速，mRNA快速降解； ⑩ RNAi效应的依赖性，只有连续产生dsRNA才能产生长期效应，否则只产生短暂的沉默反应。

41. P P P interferon production eiF2a PKR apoptosis Blockage of protein synthesis Mammals exhibit potent responses to dsRNA dsRNA cell death dsRNA 进入哺乳动物成体细胞后，细胞内病毒防御 机制被激活。细胞内干扰素产生增加，蛋白激酶PKR 激活，使转录因子E2F被抑制，非特异性的阻断基因的 转录，并诱导细胞凋亡。

42. smaller RNAs can escape the PKR pathway recall that siRNAs are intermediate effectors In the RNAi pathway siRNAs are not recognized by the PKR!

43. RNAi调控染色质甲基化 RNA干扰的一部分作用机理：由于只有在DNA未折叠的情况下基因才会表现，因此RNAi凭借甲基化等修饰组蛋白而影响局部DNA的折叠，从调控大区域的基因表现，在发育及分化的过程中扮演了极为重要的地位。而且RNAi所诱发的染色质修饰需要RNA polymeraseII的参与，而也就说明了这种凭借甲基化染色质来抑制基因表达的过程，可能也是需要先转录成RNA，然后制造siRNA以进行染色质的修饰，抑制基因的表达。

44. siRNA and Silent Chromatin - Model RNA homologous to centromeric repeats are processed – siRNAs siRNAs may recruit Clr4 histone H3 methylase result in meth. of H3 Lys9 Swi6 binds chromatin Gene silencing

46. 总之,作为一门新兴的技术，RNA干扰中还有很多的细节没有弄清楚，比如RNA干扰的所有中介物是什么，不同RISC是如何形成的。但是这并不妨碍我们对于它的应用前景的展望。总之,作为一门新兴的技术，RNA干扰中还有很多的细节没有弄清楚，比如RNA干扰的所有中介物是什么，不同RISC是如何形成的。但是这并不妨碍我们对于它的应用前景的展望。

47. RNA干扰的应用及前景 1、基因功能的研究 2、病毒性疾病的治疗 3、肿瘤的治疗 4、药物的研发

48. 1.基因功能研究 由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。

49. 2.病毒性疾病的治疗——艾滋病 Jacque et al 针对HIV-1复制的早 期和晚期, 设计针对HIV-1基因组不同区域的 siRNAs, 并转染人类细胞系、原始淋巴细胞及 CD4+HeLa细胞, 结果证明RNAi能够降低HIV-1 基因组的RNA. 《Nature 》2002

50. Introduced 22 nucleotide synthetic siRNAs (complementary to HIV target +/- GFP) into human cell lines/ primary lymphocytes RESULTS: DO NOT ACTIVATE PKR PATHWAY and siRNAs SPECIFICALLY DEGRADE HIV-1 mRNA, dsRNA-activated protein kinase