Hodnotenie ekotoxikologických vlastností vybraných obzvlášť škodlivých látok

1. Stanovenie hodnôt environmentálnych noriem kvality pre vodu a posilnenie krajských a obvodných úradov životného prostredia pri implementácii kontroly a monitorovania vôd SEMINÁR Modra, Košice 11.-15. decembra 2006 Martina Solenská Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. (ETC) Nádražná 36 900 28 Ivanka pri Dunaji Hodnotenie ekotoxikologických vlastností vybraných obzvlášť škodlivých látok ACELCooperation Agency for Local Authorities

2. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. EKOTOXIKOLÓGIA Interdisciplinárna veda, ktorá kombinuje poznatky EKOLÓGIE (študuje ekosystémy) a TOXIKOLÓGIE (interakcie chemických látok s organizmami)

3. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY • Experimentálne (zvyčajne laboratórne) metódy stanovenia toxického pôsobenia stresorov (toxických látok) na organizmy v prírode • Každý biotest v podstate predstavuje zjednodušený model ekosystému • Biotesty akútnej toxicity • Živočíchy- hodnoteným parametrom je letalita a imobilizácia napr. Daphnia magna • Autotrofné organizmy- riasy -rast - delenie množstvo chlorofylu (florescencia) • vyššie rastliny - klíčenie a rast • Rozkladači (deštruenti)- baktérie- rast, metabolická aktivita, bioluminiscencia • Biotesty chronickej toxicity • Živočíchy- neletálne parametre- rast a reprodukčné schopnosti • Autotrofné organizmy- vyššie rastliny- klíčenie, rast, tvorba gamét/semien

4. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Praktická realizácia ekotoxikologických testov Príprava organizmov (kultivačné médium, množstvo- počet, vek organizmov…) Príprava vzoriek (stanovenie sušiny, výluh riedenie vzorky – koncentračná rada, negatívna kontrola) Expozícia - podľa typu organizmu a testu akútne: 24,48,72 hodín, chronické: dni, týždne až mesiace - dávka, koncentrácia, čas Testovanie - testovaná látka -kontrola - referenčná látka Vyhodnotenie- stanovenie letality, imobilizácie, Biomasy, štatistické hodnotenie a stanovenie

5. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Praktická realizácia testov - vyhodnotenie • LC50 stredná letálna koncentrácia- štatisticky odvodená jedná dávka látky, pri ktorej sa predpokladá 50% uhynutie počas expozície alebo po určitom čase po expozícii • EC50 koncentrácia, pri ktorej sa predpokladá 50% inhibícia • NOAEL „koncentrácia nepozorovaného nepriaznivého účinku“ najvyššia dávka, pri ktorej sa nepozorujú žiadne nepriaznivé účinky • NOEC koncentrácia, pri ktorej neboli pozorované žiadne nepriaznivé účinky • LOAEL najnižšia dávka, pri ktorej sa pozorujú nepriaznivé účinky • LOEC najnižšia konc., pri ktorej neboli pozorované nepriaznivé účinky

6. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Ekotoxikologické testy • Kôrovce Stanovenie inhibície mobility Daphnia magna Stanovenie reprodukčnej toxicity (Daphnia magna) • Ryby Stanovenie akútnej toxicity na rybách (Poecilia reticulata) • Riasy Stanovenie inhibície rastu rias (Scenedesmus quadricauda) • Vyššie rastliny Stanovenie inhibície rastu (Lemna minor) Stanovenie inhibície rastu koreňa vyššej kultúrnej rastliny (Sinapis alba) • Mikroorganizmy Stanovenie inhibície luminiscencie baktérií (Vibrio fisheri) Stanovenie inhibície spotreby kyslíka aktivovaným kalom

7. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Stanovenie inhibície mobility Daphnia magna, skúška akútnej toxicity STN EN ISO 6341, OECD 202, C.2 • Princíp - stanovenie koncentrácie - EC50, ktorá za presne definovaných podmienok imobilizuje 50 % exponovaných jedincov Daphnia magna po 24 h a 48 h • V skúškach sa používajú organizmy Daphnia magna najmenej tretej generácie, ktoré boli získané acyklickou partenogenézou za špecifikovaných podmienok rozmnožovania • Organizmypoužívané v skúške majú byť mladšie ako 24 hodín, získavajú sa tak, že sa gravidné samice prenesú do nádob s čerstvou riediacou vodou a počas 24 h sa odlovia novonarodení jedinci

8. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Podmienky skúšky Skúšobné nádoby sa umiestňujú do klimatizovanej komory, v ktorej sú zabezpečené konštantné hodnoty: • intenzita svetla 400 až 800 luxov • fotoperióda 16 h • svetlo/8 h • teplota (21 °C  1°C),

9. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Priebeh skúšky • Rozsah koncentrácií sa zvolí tak, aby aspoň tri hodnoty koncentrácie ležali medzi 10 % a 90 % imobilizácie. • Pre každú koncentráciu a kontrolu je treba použiť minimálne 20 jedincov Daphnia magna, ktoré sa rozdelia do štyroch skupín po 5 jedincov • Bezprostredne po spočítaní imobilizovaných jedincov Daphnia magna sa zmeria koncentrácia rozpusteného kyslíka v skúšobnej nádobe s roztokom s najnižšou koncentráciou, v ktorej boli všetky Daphnia magna imobilizované (obsahy skúšobných nádob jednej koncentrácie sa zlejú do jednej nádoby tak, aby nedošlo k zmene obsahu rozpusteného kyslíka)

10. Výsledky Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Hodnoty 24 h a 48 h EC50 a limity zodpovedajúce 0 % a 100 % imobilizácii sa vyjadrujú: • v mg/l v prípade chemických látok, pesticídov, environmentálne vhodných výrobkov, farmaceutických prípravkov • v ml/l alebo ako percento v prípade povrchových a odpadových vôd, pórovej vody zo sedimentov

11. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Platnosť výsledkov Výsledky sa považujú za platné ak sú splnené na konci skúšky nasledovné podmienky: • koncentrácia rozpusteného kyslíka na začiatku testu musí byť najmenej 60 % za danej teploty; • koncentrácia rozpusteného kyslíka na konci skúšky je väčšia alebo rovná 2 mg/l • testované jedince Daphnia magna nesmú byť v kontrole zachytené na povrchu vody • koncentrácia testovanej vzorky musí byť udržiavaná v rozsahu 80 % pôvodnej koncentrácie počas celého testu • hodnota pH sa nesmie meniť o viac ako 1 jednotku pH • percento imobilizácie v kontrolnej vzorke je menšie alebo rovné 10% • 24 h EC50 dichrómanu draselného je v rozsahu 0,6 mg/l – 2,1 mg/l.

12. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Stanovenie reprodukčnej toxicity (Daphnia magna) STN ISO 10706, OECD 211, C.20 Hlavným cieľom skúšky je zhodnotiť účinok chemických látok a prípravkov, povrchových a odpadových vôd, pórovej vody zo sedimentov, farmaceutických prípravkov a pesticídov na reprodukciu Daphnia magna • Rodičovské organizmy - samičky Daphnia magna, ktoré sú prítomné na začiatku skúšky a ktorých schopnosť reprodukcie je predmetom štúdie. • Potomstvo - mladé organizmy Daphnia magna, vyprodukované rodičovskými organizmami počas trvania skúšky.

13. Princíp Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. - mladé samice rodu Daphnia (rodičovské organizmy), mladšie ako 24 hodín na začiatku skúšky, exponované rade koncentrácií skúšanej látky - trvanie skúšky je 21 dní - na konci skúšky sa hodnotí celkový počet živého potomstva produkovaného rodičovským organizmom, ktorý prežil do konca skúšky - mladé jedince produkované dospelými jedincami, ktoré uhynuli počas skúšky sú vylúčené z výpočtov - na stanovenie LOEC a NOEC sa porovnáva reprodukcia živočíchov exponovaných skúšanej látke s reprodukčnou schopnosťou organizmov v kontrole - EC50 - koncentrácia, ktorá spôsobí 50 % redukciu reprodukčnej schopnostizaznamenáva sa i prežívanie rodičovských organizmov, môžu sa sledovať aj iné účinky spojené s pôsobením testovanej látky ako je napr. čas produkcie prvého vrhu

14. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Podmienky testu • rovnaké ako pri teste akútnej toxicity Výmena testovaného média • frekvencia výmeny média závisí od stability testovanej látky a mala by sa vykonávať najmenej tri krát za týždeň • pri semistatických testoch sa médium mení tak, že sa pripraví druhý súbor testovacích nádob a rodičovské organizmy sa do nich prenesú automatickou pipetou so špičkou primeraného objemu, pričom sa minimalizuje objem média, ktorý sa prenesie spolu s jedincami Daphnia magna

15. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Mladé organizmy • každý deň, odo dňa, kedy sa objavilo prvé potomstvo (aby sa tak predišlo konzumácii potravy určenej pre dospelé jedince) treba spočítať a premiestniť  mladé jedince, vyprodukované rodičovským organizmom • počítajú sa len živonarodené jedince, ale mala by sa zaznamenať prítomnosť nevyvinutých vajíčok alebo mŕtvych mladých jedincov Mortalita • Mortalita dospelých organizmov by sa mala zaznamenávať denne, najmenej však vtedy, kedy sa počítajú mladé jedince

16. Vyhodnotenie a cieľ skúšky Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Cieľom tohto testu je stanoviť účinok testovanej látky na celkový počet mladých, živých organizmov na živý rodičovský organizmus na konci testu (ak rodičovský organizmus počas testu zahynie alebo sa premení na samčeka, potom sa tento testovaný súbor z ďalšej analýzy vylúči) • Celkový počet mladých organizmov na rodičovský organizmus sa vypočítava pre každú z testovaných nádob (t.j. paralelne testovaný súbor) • Priemer pre každú koncentráciu sa porovnáva s priemerom v kontrole Pri odhade LOEC a  NOEC, pri stanovení účinkov chemickej látky na reprodukciu je nevyhnutné vypočítať priemernú reprodukciu zo všetkých paralelne testovaných súborov pre každú koncentráciu a štandardnú odchýlku, čo je možné vykonať použitím analýzy rozptylu (ANOVA)

17. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. • Platnosť skúšky • Skúška je platná ak sú dodržané nasledovné kritériá v kontrole: • mortalita u rodičovských organizmov nesmie na konci skúšky presiahnuť 20 %, • priemerný počet živých jedincov, vyprodukovaný na 1 živý rodičovský organizmus na konci musí byť 60. Okrem odhadu reprodukčnej schopnosti, je možné týmto testom stanoviť i iné účinky, napr. čas, ktorý je potrebný na produkciu prvého potomstva, počet a veľkosť potomstva na jedinca, počet nevyvinutého potomstva, počet samčích jedincov a  pomer populačného rastu

18. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Stanovenie akútnej toxicity na rybách (Poecilia reticulata) STN EN ISO 7346 – 1, -2, OECD 203, C.1 Princíp skúšky • Ryby sú exponované testovanej látke pridanej do vody v rôznych koncentráciách počas 96 h. • Úmrtnosť sa zaznamenáva po 24 h, 48 h, 72 h a 96 h • Skúška môže byť statická alebo semistatická Statická skúška • Skúška bez výmeny skúšobného roztoku počas skúšky. Semi-statická skúška • Skúška s pravidelnou výmenou skúšobného roztoku v určitých časových intervaloch (napr. každých 24 h)

19. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Skúšobné organizmy • Skúšobným druhom v EL je Poecilia reticulata, prípadne Brachydanio rerio • celkovú dĺžka 25 mm  5 mm, čo všeobecne zodpovedá hmotnosti 0,3 g  0,1 g. • Ryby sa aklimatizujú pred začiatkom skúšky v riediacej vode 7 dní s nepretržitým vzduchovaním, za rovnakých podmienok kvality vody a osvetlenia ako pri skúške • Ryby sa kŕmia normálne až do 24 hodín pred začiatkom skúšky, kedy sa kŕmenie preruší. • Ryby nesmú trpieť žiadnymi chorobami alebo viditeľnými malformáciami. • Nesmú byť v prípade ochorenia ošetrované počas skúšky ani 2 týždne pred skúškou

20. Podmienky skúšky Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. • Skúšobné nádoby sa umiestňujú do klimatizovanej komory v ktorej sú zabezpečené konštantné hodnoty: • teplota (21 °C  1 °C) • fotoperióda 16 h • svetlo/8 h •  intenzita svetla 400 až 800 luxov. • Roztoky sa počas skúšky neprevzdušňujú • Pri zmene zásobnej populácie rýb sa musí vykonať skúška toxicity, použitím vhodnej referenčnej látky - dichrómanu draselného (K2Cr2O7)

21. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Priebeh skúšky • Po stabilizácii teploty skúšobných roztokov na 21 °C ± 1 °C sa do každej skúšobnej nádoby umiestni 7 rýb • Ryby sa zo zásobnej nádrže vyberajú náhodne a náhodne sa aj rozdeľujú do skúšobných nádob, (ryby, ktoré počas prenosu padli sa zo skúšky vyradia, prenos – do 30 min) • V prípade semistatickej skúšky sa po 24 alebo 48 h pripravia nové testované roztoky do nových testovacích nádob a ryby sa do nich preložia • Počas skúšky sa zaznamenáva množstvo uhynutých rýb v každej nádobe aspoň raz denne • Uhynuté ryby sa musia odstrániť čo najskôr • Treba zaznamenať akékoľvek abnormálne správanie rýb • V každej nádobe sa denne sleduje koncentrácia rozpusteného kyslíka a pH

22. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Výsledky a platnosť skúšky Stanovenie LC50 • Koncentrácia spôsobujúca 50% úmrtnosť rýb Poecilia reticulata alebo Brachydanio rerio (LC50) sa vypočítava v každom pozorovanom čase (24 h LC50, 48 h LC50, 72 h LC50 a 96 h LC50) Platnosť skúšky • koncentrácia rozpusteného kyslíka počas skúšky v skúšobných roztokoch musí byť minimálne 60 % • koncentrácii skúšanej látky nesmie významne klesať v priebehu skúšky (potom sa vykonáva semistatický test) • mortalita rýb v kontrole nemôže prekročiť 10 % na nádobu • počet rýb v kontrole, ktoré preukazovali abnormálne správanie nesmie prekročiť 10 % na nádobu • 24 h LC50 referenčnej látky - napr. dichrómanu draselného (K2Cr2O7) pre daný zásobný chov rýb musí byť v súlade s výsledkami LC50 získanými v minulosti.

23. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Stanovenie inhibície rastu rias (Desmodesmus subspicatus)STN EN ISO 8692, OECD 201, C.3 Princíp skúšky • Cieľom je zistenie účinkov skúšanej vzorky na rast jednobunkových zelených rias: Desmodesmus subspicatus, ktoré sa počas niekoľkých generácií kultivujú v definovanom médiu, ktoré obsahuje rad koncentrácií skúšanej látky alebo vody a inokula exponenciálne rastúcich riasových buniek • Skúšobné roztoky sa inkubujú 72 h ±2h. Za tento čas sa hustota buniek v každom skúšobnom roztoku meria každých 24 h • Inhibícia sa meria ako redukcia rastu alebo rastovej rýchlosti v pomere k rastu kontrolných kultúr kultivovaných za rovnakých podmienok

24. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Definície • Hustota buniek - počet buniek na jednotku objemu (1 ml). • Rast - zvyšovanie hustoty buniek počas testu. • Špecifická rýchlosť rastu – rýchlosť úmerná prírastku hustoty buniek za jednotky času. • Skúšobný roztok– zmes vody, živín a skúšanej látky, v ktorej sa inkubujú riasové bunky. • Kontrolný roztok– zmes vody, živín a riasových buniek bez skúšanej látky. Skúšobný organizmus Desmodesmus subspicatus (86.81 SAG), Chlorophyta, z Botanického ústavu SAV, Bratislava

25. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Podmienky skúšky • klimatizovanej miestnosti • teplota 24°C ± 1°C • nepretržite osvetlenie • biele fluorescenčné svetlo • Intenzita od 6 000 do 10 000 luxov Priebeh skúšky • Skúška sa vykonáva bez úpravy pH • Hustota buniek sa meria v každej skúš. nádobe (aj kontrola) raz za 24 h • Tieto merania sa vykonávajú s malými objemami odobratými zo skúšobných roztokov pipetou • Na meranie hustoty buniek sa používa mikroskop s počítacou Bűrkerovou komôrkou • Skúška trvá 72 h • Na konci skúšky sa zmeria pH skúšobných roztokov v každej koncentrácii i v kontrolnej vzorke

26. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. Vyhodnotenie výsledkov • Zostrojenie rastových kriviek • Pre každú skúšanú koncentráciu a kontrolnú vzorku sa zostrojí graf rastových kriviek • Zistené bunkové koncentrácie v skúšaných kultúrach a kontrolách sa prezentujú vo forme tabuľky spolu s koncentráciami skúšanej vzorky a časom merania. • Priemery bunkových koncentrácií sa uvádzajú pre každú skúšanú koncentráciu a pre kontrolu v časovom priebehu, čím vzniknú rastové krivky • Výpočet inhibície v percentáchsa používa pre stanovenie vzťahu účinku a koncentrácie pre každú testovanú koncentráciu a vypočíta sa na základe  rýchlosti rastu (výpočet podľa STN EN ISO 8692). • Stanovenie EC50 Hodnoty EC50 vypočítané z plochy pod rastovou krivkou (biomasa) sa označia ako EbC50 a z rastovej rýchlosti ako ErC50

27. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. • Platnosť testu • rastová rýchlosť 1,4 d-1 (67-násobok –zvýšenie hustoty buniek po 72 h • pH nesmie sa zvýšiť o viac ako 1,5 jednotky • variačný koeficient rastovej rýchlosti v kontrole nesmie prekročiť 5%

28. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o.

29. Ekotoxikologické centrum Bratislava s.r.o. • Čiastkové výsledky akútnych testov