IMMUNOBLOTTING Pag. 322 par. 7.6

1. IMMUNOBLOTTING Pag. 322 par. 7.6

2. Blocking molti siti di legame della membrana (di nitrocellulosa o PVDF) rimangono liberi da proteine dopo il trasferimento quindi si devono bloccare questi siti con BSA o dry Milk (latte in polvere) prima dell’incubazione con anticorpi La BSA e’ generalmente piu’ purificata del latte in polvere ma contiene epitopi identici, quindi ha meno capacità “bloccante” rispetto al latte Il latte tuttavia non e’ raccomandato se si usano anticorpi che riconoscono carboidrati.

3. Il detergente nonionico Tween-20 (stringenza dell’ ibridazione) Il TWEEN nel buffer di incubazione con l’anticorpo serve per interferire con il legame aspecifico dell’anticorpo alla membrana Un effetto indesiderato e’ che il Tween interferisce anche con il legame tra antigene e anticorpo e puo’ causare la dissociazione delle proteine dal filtro. Quindi la concentrazione di Tween deve essere attentamente calibrata e dipende dalla forza dell’ interazione tra ligando e anticorpo

4. Anticorpo secondario Coniugato a: Fluoroforo o HRP o AF Anticorpo secondario Anticorpo primario Membrana Proteina legata alla membrana • Immuno-blotting : • separazione del campione tramite PAGE (Poliacrilammide gel elettroforesi) • Western blotting: trasferimento delle proteine separate elettroforeticamente su membrana • “BLOCKING”: bloccaggio dei siti aspecifici • Rivelazione con anticorpi: primari (che riconoscono e legano recognize la proteina specifica di interesse) e secondari

5. Perché nell’immunodetection si usa un anticorpo secondario? Anticorpo secondario Coniugato a: Fluoroforo o HRP o AF L’anticorpo secondario riconosce specificamente le IgG del primario Anticorpo secondario Anticorpo primario Membrana Proteina legata alla membrana ed è coniugato con composti che ne permettono la evidenziazione

6. Anticorpo secondario Coniugato a: Fluoroforo o HRP o AF Anticorpo secondario Anticorpo primario Membrana L’ anticorpo secondario può essere coniugato a: . -fluorofori, - colloidi d’oro -radioisotopi o, piu’ comunemente, ad un enzima (es. Fosfatasi alcalina AF o perossidasi di rafano HRP)

7. Ab secondario coniugato ad HRP Substrato ECL Luce emessa M E M B R A N A P X-Ray film CCD camera Ab primario ECL (Enhanced Chemioluminescence System) Rivelazione: La perossidasi di rafano (HRP) in presenza di perossido di idrogeno ossida il suo substrato, il luminolo, con concomitante emissione di luce 10 volte piu’ sensibile di un metodo colorimetrico

8. Colorazione delle proteine su carta Ponceau S

9. Colorazione delle proteine trasferite su carta con Ponceau S e’ un metodo rapido e reversibile di colorazione delle proteine dopo trasferimento su carta. meno sensibile del Comassie ma NON interferisce con le procedure di immuno-detection Ponceau S C22H12N4O13S4.Na4 Ponceau S Staining Solution :(0.1%(w/v) Ponceau S in 5%(v/v) acetic acid)

10. Es. Colorazione su membrana: Es. Colorazione su gel: ECL detection su membrana NC Gel SDS-PAGE colorato con CBB Sec4GFP MW 1 2 Sec4 Membrana colorata con PonceauS

11. Altri tipi di elettroforesi: One Dimensional (1D) Protein Electrophoresis Separation: Isoelectric focusing (IEF) (par 10.3.4) 2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1

12. Isoelectric focusing (IEF) IEF e un metodo per separare le proteine secondo il loro punto isoelettrico In un gradiente di pH e in presenza di un campo elettrico le proteina migreranno fino a raggiungere il punto nel gradiente dove la loro carica e’ nulla: Cioè al loro Punto isoelettrico

13. Per creare i gradienti nel gel si usano anfoliti = miscele complesse di di acidi poliammino-policarbossilici sintetici IEF impiega gel orizzontali su piastre di vetro o fogli di plastica e percentuali di acrilammide e agarasio che permettono la libera mobilità dela molecole Gli anfoliti coprono diversi di pH (es.pH 3-10 o pH7-8) Il range di pH va scelto in dipendenza dei pI delle proteine di interesse

14. . Isoelectric focusing of proteins(IEF) Utile per separare proteine con differenti modificazioni (es. Fosforilazioni) o isoenzimi Creazione di un gradiente di pH usando anfoliti http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/Elpho_IEF+Separation • Nessun voltaggio applicato • Gli anfoliti e le proteine si muovono quando • la corrente e’ applicata secondo la loro carica • C. Al pH isolelettrico le proteine sono “focused” • cioè ferme

15. PROTEOMICA

16. ID pH 11 pH 2 2D L'elettroforesi bidimensionale (2D-Gels) ID=IEF. Le proteine vengono assorbite su strisce di gel secchi che hanno gradienti di pH immobilizzati. Una volta idratate e applicato il campo elettrico le proteine acide che si trovano sul lato alcalino del gel dissoceranno e saranno caricate negativamente. A causa del campo elettrico queste proteine migreranno al polo positivo (il lato acido del gel). . 2D=SDS-PAGE I E F 2D: SDS-PAGE Gel figure from http://www.microbiology.science.ru.nl/tech/twod/

17. The MALDI-ToF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) MALDI ToF permette l’ analisi rapida di proteine digerite purificate da spots ottenuti da gel 2D or possibilmente 1D gel, by peptide mass fingerprinting. Parent masses of whole intact proteins can also be measured. Questo strumento è anche eccellente per determinare modificazioni che cambiano la massa o lo stato di carica di proteine note. Es. di uno strumento di Maldi-Tof in commercio

18. Sistema ad alto vuoto Analisi dati sorgete di ioni Analizza-tore di massa rivelatore entrata MALDI Spettrometria di Massa MS-MALDI TOF -Le molecole di campione sono convertite in ioni gassosi -gli ioni sono poi accellerati in un campo elettrico o magnatico o viene misurato il TOF di ioni di massa diversa in una data distanza - separati da un’analizzatore di massa-carica (m/z) -il rivelatore detrmina il rapporto massa/carica di ogni specie ionizzata TOF TOF=Time of Flight Tempo impiegato da ioni di massa diversa per percorrere un data distanza MALDI-TOF (Ionizzazione per desorbimento laser assistito da una matrice) Time of flight) mass spectometer

19. 2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1 MALDI, spettrometria di massa TOF e MALDI-TOF Pag.408-419 paragrafo 9.3.7

20. Fonte di luce rivelatore Elettroforasi capillare dati tempo A S S O B A N Z A anodo catodo L’elettroforesi capillare e’ usata per la separazione analitica delle proteine, aminoacidi, peptidi e frammenti di DNA

21. TIPI di ELETTROFORESI CAPILLARE CE: Elettroforesi capillare, CZE: elettroforesi capillare in soluzione libera HPCE: elettroforesi capillare zonale

22. Fonte di luce rivelatore Elettroforasi capillare dati tempo A S S O B A N Z A anodo catodo Alto voltaggio (typicamente 10-30kV) capillare sottile (25-100mm). Le estremità del capillare sono immerse nel serbatoi riempiti con l’elettrolita. Gli elettrodi sono fatti di platino e sono anche inseriti nei serbatoi con l’elettrolita. Il campione (nanomoli) viene inniettato a una estremità nel capillare. Generalmente un rivelatore ad assorbanza UV si trova alla estremità opposta del capillare.Il rivelatore genera un grafico in funzione del tempo Vantaggi: nanolitri di campione sono sufficienti e l’analisi è effettuata in tempo reale con alta sensibilità (fentomoli 10-15)

23. Tecniche cromatografiche Nella cromatografia si definisce : una fase mobile (liquida o gassosa che fluisce sopra o attraversa una fase stazionaria (un solido, un gel, un liquidoo una miscela solido liquido immobilizzata). I composti che devono essere separati si devono distribuire trafase mobileestazionariain modo che abbiano diversi coefficienti di distribuzione

24. Cromatografia su colonna. La fase stazionaria è attaccata ad una matrice (un supporto inerte e insolubile) impaccata in una colonna la fase mobile passa attraverso la colonna per gravità o usando un sistema di pompaggio oppure un gas sotto pressione.

25. Caricamento del campione Aggiunta del solvente Colonna contenente la fase stazionaria Recupero del campione Schema di una semplice separazione in cromatografia a fase liquida La cromatografia a fase mobile liquida semplice consiste di una colonna che tiene una fase stazionaria nell'equilibrio con un solvente.

26. Le fasi stazionarie tipiche (e le loro interazioni con i soluti) • sono: • solidi (assorbimento Es. Silice QIAprep), • gruppi ionici su una resina (scambio ionico), • liquidi su un supporto solido inerte (di ripartizione ) e • particelle inerti porose (size-esclusion).

27. Le molecole pi ù grandi del formato Cromatografia di gel filtrazione del poro non possono entrare nei pori ed eluiscono insieme al primo picco nel cromatogramma. Le molecole che possono entrare nei pori avranno un tempo di soggiorno medio nelle particelle che dipende dal formato e dimensione delle molecole. Le molecole differenti quindi hanno tempi totali differenti di transito attraverso la colonna. Le molecole che sono pi ù piccole di il formato del poro pu ò entrare in tutti i pori ed hanno il tempo massimo del soggiorno sulla colonna e si eluiscono insieme come l'ultimo picco nel cromatogramma. Questo Campioni piccoli ultimo picco nel cromatogramma Campioni grandi determina il limite totale di permeazione

28. La cromatografia a fase liquida (LC) è una tecnica cromatografica analitica che è utile per la separazione gli ioni o di molecole dissolte in un solvente. La soluzione del campione rimane a luogo in contatto con una seconda fase solida o liquida, i soluti differenti interagiranno con l'altra fase secondo le differenze nell'adsorbimento, scambio ionico, dimensione o forma. I componenti della miscela si separeranno usando queste differenze ed esse determineranno il periodo di transito dei soluti attraverso una colonna

29. La scelta tra fase mobile e stazionaria viene fatta in modo che i composti da separare abbiano diversi coefficienti di distribuzione Kd Kd descrive il modo in cui un composto si distribuisce tra due fasi immiscibili A e B a temperatura costante. Kd =(concentrazione nella fase A/ concentrazione nella fase B)

30. Capacità di ritenzione (K’) è la quantità totale di sostanza presente in una fase divisa la quantità totale presente nell’ altra fase In pratica Capacità di ritenzione K’= Kd. VA/VB Kd=coefficiente di distribuzione(concentrazione relativa dell’analita tra ledue fasi) VA=volume del composto A; VB=volume del composto B

31. Tre diversi metodi di eluizione: • semplice o progressiva; • a stadi; • a gradiente di potere eluente. • Eluizione semplice • la fase mobile rimane la medesima durante tutta l'eluizione e le sostanze escono dalla colonna in dipendenza dai loro coefficienti di ripartizione B. L'eluizione a stadi si utilizza quando si vogliono separare due sostanze che presentano un coefficiente di ripartizione molto diverso tra la fase fissa e la fase mobile utilizzate.

32. C. Eluizione a gradiente di potere eluente la variazione della composizione della fase mobile è progressiva, anziché brusca come nel metodo a stadi. Questo metodo di eluizione viene utilizzato soprattutto quando le sostanze che costituiscono la miscela in studio presentano valori molto diversi di coefficiente di ripartizione tra fase fissa e fase mobile.

33. I componenti che si eluiscono dalla colonna possono essere misurati da un rivelatore e/o essere raccolti per ulteriore analisi.

34. Cromatogramma e parametri che influenzano la risoluzione cromatografica

35. A280 Pick2 Pick1 Vr2 Vr1 Volume di eluizione Wb1 Wb2 Wb1=ampiezza del picco1 Wb2=ampiezza del picco2 Vr1=il volume del picco 1 Vr2=il volume del picco 2

36. R= Vr2 - Vr1 ½ (Wb2 + Wb1) Risoluzione: è la misura della separazione relativa raggiunta tra due materiali cromatograficamente distinti Wb1=ampiezza del picco1 Wb2=ampiezza del picco2 Vr1=il volume del picco 1 Vr2=il volume del picco 2 La massima risoluzione è lo scopo primario di ogni purificazione

37. Capacità o fattore di risoluzione k E’ la misura della ritenzione di un componente del campione da non confondere con la capacità di caricamento della colonna Vm= volume della fase mobile Vr2= volume di eluizione del picco 2 k = Vr2-Vm Vm

38. EFFICIENZA (N) Pick1 E’ la misura dell’ampiezza del picco di eluizione della colonna Pick2 Vr1 Vr2 Wb1 Wb2