1. 生物化学实验 CQMU 生物化学综合实验血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 P、180 重庆医科大学基础医学实验教学中心 生物化学与分子生物学实验室 2008年10月

2. 实验目的 从人血清中分离纯化γ-球蛋白 实验方法 一、盐析法粗分γ-球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度 本实验综合多种实验技术和方法，共同完成一个实验目标，所以属于综合性实验。

3. 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 【实验目的】 1．学习了解凝胶层析和离子交换层析分离纯化 蛋白质的基本原理及应用 2．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用

4. 蛋白质分离纯化与鉴定 【基本原理】 蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。 分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质的不同而建立的方法，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳、离心等。在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。

5. 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 【实验原理】 本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。

6. 一、盐析法粗分离血清γ-球蛋白 原理 盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度度不同，从而分别析出，达到彼此分离的分离方法。 本实验在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶解，球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液。

7. 盐析法分离血清球蛋白 硫酸铵是蛋白质盐析常用的中性盐，在0～30℃范围内溶解度变化不大；25℃时饱和溶解度为4.1 mol/l，0℃时饱和溶解度为3.9 mol/l。在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以析出来。而且硫酸铵价廉易得，分段盐析效果好，不容易引起蛋白质变性。

8. 具体操作 硫酸铵分段盐析：血清1.0 ml，一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵1.0 ml，混匀后室温下静置10分钟，3000 rpm离心10分钟。用滴管仔细地吸出上清，弃去。沉淀加0.02 mol/l pH 6.5 磷酸缓冲液4.0 ml溶解，此为球蛋白粗提液，留作进一步纯化。

9. 二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐 欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法： 凝胶层析法 透析 本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。

10. 凝胶柱层析脱盐

11. 目的与要求 1.学习了解凝胶 层析的原理 2.熟练了解凝胶 层析的用途

12. 凝胶层析原理： 凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。 凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时，直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。

13. 凝胶层析法原理 凝胶层析法又叫凝胶过滤。基本原理是用一般的柱层析方法使分子量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相从而使物质分离。它利用一些多孔的细珠支持物，这些小孔大小不一，可以允许半径在一定范围内的分子透过它。把经过充分溶胀的凝胶装入层析柱中，加入样品后，由于凝胶的三维空间网状结构，分子量小的物质能进入凝胶，流程长，移动速度慢。分子量大的物质则被排阻在交联网状物之外，沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析床。经过分部收集流出液，分子量不同的物质便互相分离。

14. 分子筛层析

15. 葡聚糖凝胶（Sephadex) 应用最多的凝胶！

16. 操作步骤： ▲ Sephadex G-50的准备 ▲ 装柱（15~20cm） 1、层析柱保持垂直。 2、放蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。 3、加入搅拌均匀的SephadexG-50悬液，调节流速10滴/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 4、上留1—2mm的水，关闭出口。 注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。 ★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。

17. ▲加样与洗脱 1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶。 2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收 集洗脱液，用钠氏试剂检测胺。 3、保存：检测洗脱液的蛋白质量，保存含量高的进一步纯化 ▲凝胶的再生 不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。

18. 注意事项： 1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。 ★以管号为横轴，蛋白质含量为纵轴绘制洗脱曲线，分析实验结果。

19. 三、DEAE－纤维素离子交换层析 【实验目的】 1. 通过使用DEAE－纤维素离子交换层析法，进一步 纯化γ-球蛋白脱盐液，得到较纯的γ-球蛋白溶液 2. 学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用范围

20. 离子交换层析的基本原理 离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定相。如果其带负电，则能结合阳离子，成为阳离子交换剂；如果其带正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂。可根据实验需要，选择不同的离子交换剂进行离子交换层析。 DEAE （二乙基氨基乙基）－纤维素含有可离子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂。

21. 离子交换层析的基本原理 靠静电引力结合在交换剂上的离子，叫做平衡离子 应用离子交换层析时要找到适当的条件，使一些化合物带电结合到交换剂上，而使另一些化合物不结合到交换剂上。在本实验条件下， DEAE－纤维素是具有带多个正电荷游离碱基的聚合物，所以主要靠静电吸引与带负电的蛋白质形成离子键，对蛋白质提纯有很大好处

22. 蛋白质的电离示意图

23. DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白 血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白的等电点为： 清蛋白pI=4.64， α2球蛋白pI=5.06， β球蛋白pI=5.12， γ球蛋白pI=7.3 本实验采用0.02 mol/l pH6.5 NH4Ac缓冲液进行洗脱。在此pH条件下，DEAE带正电荷，可与带负电荷的α、β-球蛋白和清蛋白结合，而带正电荷的γ-球蛋白不与DEAE结合，首先从层析柱中洗脱出来，首先收集到的既是纯化的γ-球蛋白。

24. 操 作 将脱盐后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝胶过滤），用0.02 mol/l pH 6.5 NH4Ac缓冲液洗脱，流速10滴～15滴/分，用小试管连续收集流出液（约1.5 ml/管），用紫外分光光度计在λ280 nm下测其吸光度值，收集含量最高的部分，浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是γ－球蛋白。

25. 四、γ－球蛋白纯化液的浓缩 利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量凝胶，离心，浓缩蛋白。 每ml纯化γ－球蛋白溶液加SephadexG25 0.25 g，摇动2～3分钟，室温静止2小时离心，上清即为浓缩γ-球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）。

26. 五、γ－球蛋白鉴定 用醋酸纤维素薄膜电泳的方法，以血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳）。

27.   原理 • 以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。 • 在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中均带负电荷，向正极移动。 • 带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。

28. 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 点样 ： 全血清：点样一次 脱盐后的粗蛋白溶液：点样3～5次 浓缩后的纯γ－球蛋白溶液：点样3～5次

29. 醋酸纤维素薄膜电泳 电泳条件：电压：90－110 V； 时间：50分钟。 染 色：电泳毕，关电源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B 染色液的染色缸中染色5分钟，用2.5 %醋酸洗脱液漂洗，直至背景呈白色。取宽薄膜一张，3个样品点在同一水平，以血清蛋白图谱为对照，观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何。

30. 操作步骤： 1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极 。 2、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻轻吸 干—半干燥态。铅笔标记；点样器沾适 量新鲜血清，垂直点样。 3、放入电泳槽，使膜保持水平。 4、通电：110伏，1小时。断电后，取膜。 5、染色：氨基黑10B染色10min。 6、浸洗：浸洗液浸洗3次，每次5-10min。 快

31. 铅笔标记 ，垂直点样 半干燥态 + 保持膜不下垂

32. 按泳动快慢顺序分为：清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白。按泳动快慢顺序分为：清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白。

33. 注意事项： 1 、区分电泳槽正负极。 2 、点样处放在负极端，保持膜水平。

34. 试剂材料 饱和硫酸铵溶液 纳氏试剂 Sephadex G 25 DEAE－纤维素 醋酸纤维素薄膜

35. 仪器 离心机 层析柱 紫外分光光度计 小烧杯 小试管 铁架台及铁夹 电泳槽 白瓷板等。

36. 注意事项 1．盐析时应逐滴加入饱和硫酸铵，边加边摇，静止要充分。 2．装柱时柱内要严防断层与气泡，凝胶床面要平整。 3．准确配制NH4Ac缓冲液并严格调整其PH至6.5。 4．保持层析柱床表面完整,上样或加缓冲液时,动作应轻、慢， 切勿将柱床表面冲起.上样时小心控制下端聚乙烯管.严防空 气进入层析柱床内。 5．样品进入床内,打开出口后应立即收集.洗脱时注意收集样 品,切勿使样品丢失,并注意不要使层析柱干涸,保留部分液 体在凝胶柱床表面。 6．本次实验填柱料Sephadex G25和DEAE-纤维素价钱 昂贵，在使用时应注意随时回收重复使用。

37. 思考题 1．除了用凝胶过滤方法除去样品中盐外，还可以用哪 些方法除盐？ 2．离子交换层析和凝胶过滤分离蛋白质的原理是什么？ 3．如何对分离、纯化后所得到的γ-球蛋白的纯度和 含量进行鉴定？ 4．如何从血清中分离纯化免疫球蛋白G？