A génaktivitás szabályozása

1. A génaktivitás szabályozása

2. Nem minden gén nyilvánul meg állandóan • Sejt típusa (egérben ~200), sejtciklus állapota • Minden sejttípusban ugyanaz a genetikai állomány (kevés kivétellel) • Egy bizonyos géntermék szintézisét génszabályozási mechanizmusok ellenőrzik • A génaktivititást a transzkripció szinten • Szignálok kívülről, vagy sejten belülről • Ha kell ki/bekapcsolás

3. A génexpresszió ellenőrzési pontjai • DNS átrendeződés – DNS szekvencia helye a genomban • Transzkripciós szabályozás – RNS szintézis iniciáció/termináció • RNS processzálás – splicing/alternatív splicing • Transzlációs szabályozás • mRNS stabilitás • Poszttranszlációs szabályozás – enzimaktivitás, aktiválás, stabilitás, stb.

4. Prokarióták vs eukarióták • Prokarióták – maximális növekedés az adott körülmények között, kivéve, ha végzetes • Transzkripció és transzláció egyszerre, egy helyen (splicing nem) • Eukarióták – egyedfejlődés, osztódás és specializálódás • Felnőttben – fenntartás, tápanyagok nem változnak olyan drasztikusan

5. Transzkripció szabályozása prokariótákban • Gyakran ki/be, csak akkor,ha a géntermék kell (A Ki leggyakrabban nagyon kicsi expressziót jelent (eukariótákban az egyedfejlődésnél)) • Koordinált szabályozás – egy, vagy több metabolizmus útvonal génjei együtt, policisztronos mRNS (eukarióta monocisztronos)

6. Katabolizmus útvonalak (degradatív) • Indukálható, kis inducer molekula • Anabolikus útvonalak (bioszintézis) • Végtermék elég, represszálható enzimszintézis, kis korepresszor molekula

7. Két fő kategória: negatív, pozitív szabályozás

8. Indukálható rendszer: • Negatív szabályozás: a represszor fehérje megakadályozza a transzkripciót; az inducer antagonizálja a represszort; van transzkripció • Represszálható rendszer: aporepresszor+korepresszor=funkcionális represszor nincs transzkripció • Pozitív szabályozás: mRNS csak akkor, ha transzkripciós aktivátor kapcsolódik az aktiválandó gén megfelelő régiójához • Autoreguláció: fehérje a saját génjét +/-

9. Laktóz metabolizmus és az operon • E. coli laktóz hasznosítás szabályozásának genetikai analízise • Lac-mutánsok • Két gén - β-galaktozidáz, laktóz permeáz – szükséges • Néhány száz Lac- mutáns: kromoszómán és F’lac-on • F’×F- mating = parciális diploidok; F’ lac- / lac+ és F’ lac+ / lac- = mind Lac+ • F’ lac- × lac- → Lac+ fenotípusra szelektálva 2 komplementációs csoport, legalább két gén (lacZ, lacY), legalább két gén! (LacA laktóz transzacetiláz később, mert nem esszenciális a laktóz hasznosításhoz.)

10. F’lacY- lacZ+/lacY+lacZ-és F’lacY+lacZ-/lacY-lacZ+→ Lac+ fenotípus • F’lacY-laZ+/lacY-lacZ+és F’lacY+lacZ-/lacY+lacZ- → Lac- fenotípus lacZ → β-galaktozidáz lacY → laktóz permeáz • lacZ és lacY nagyon közel, kotranszdukcióval térképezve

11. Génexpresszió baktériumokban – néhány fontos megkülönböztetés: Szabályozott gének Sejt növekedés és sejtosztódás szabályozása. Megnyilvánulásukat (expresszió) a sejt szükségletei és a környezet szabályozzák, szükség szerint, nem folyamatosan működnek. Konstitutív gének Folyamatosan kifejeződnek. Háztartási gének (housekeeping genes), mint pl. a fehérjeszintézishez és a glükóz metabolizmushoz szükséges gének. *Valamelyik szinten minden gén szabályozott!

12. Operon – mi az? Gének csoportja (cluster), amelyeknek expresszióját operátor-represszor fehérje kölcsönhatás szabályozza, operátor régió és a promóter. • Egy operon részei: Promóter Represszor Operator (ellenőrző hely) Kódoló szekvenciák (gének, cisztronok, ORF-ek) Terminátor • Egymás melleti kódoló szekvenciák (pl., baktériumok, mtDNS) együtt íródnak át poligénes (policisztronos) mRNS-sé.

13. Inducer és indukció: • Inducer = kémiai, vagy környezeti ágens, ami egy operon transzkripcióját iniciálja. • Indukció = géntermék(ek) szintézise az inducerre adott válaszként.

14. Operon szerveződése

15. E. coli lac operonja: • AzE. colia glükóz metabolizmus géneket folyamatosan kifejezi (konstitutív gének). • Az alternatív cukorok (pl. laktóz) metabolizmusa specifikusan szabályozott. • laktóz= diszaccharid (glükóz + galaktóz), energia forrás. • A laktózinducer (efektor molekula), három fehérje termelését az 1000-szeresére növeli: • -galaktozidáz (lacZ) • A laktózt glükózra + galaktózra hidrolizálja. • A laktózt allolaktózzá alakítja, ez regulálja alac operont. • Laktóz permeáz (lacY) • Laktóz transzport a citoplazma membránon. • Transzacetiláz (lacA) • A többi szacharidot acetilezi.

16. Az E. coli lac operon: Francois Jacob és Jacques Monod • Két különböző mutáció típust vizsgáltak a lac operonban: • Mutációk a fehérje-kódoló génszekvenciákban. • Mutációk a szabályozó szekvenciákban.

17. Fehérje kódoló gének szekvenciáiban mutánsokkal térképezték a géneket: • lacZ (-galaktozidáz)knock-out mutánsok (funkció vesztés) gátolják alaktóz permeáz (lacY) és a transzacetiláz (lacA) funkciókat. • lacY (laktóz permeáz) knock-out mutánsok gátolják a transzacetiláz (lacA) funkciót, de nincsenek hatással a -galaktozidázra (lacZ). • lacA (transzacetiláz) knock-out mutánsok sem a-galaktozidázt (lacZ) sem pedig a laktóz permeázt (lacY) nem befolyásolják. Következtetés: a 3 lac operon gén a következő sorrendben kapcsolt: • lacZ • lacY • lacA

18. Alac operon transzlációja vad típusúés mutánsE. coli-ban.

19. 2. A gén-megnyilvánulást befolyásoló mutációk a regulátor szekvenciákban: Jacob és Monod olyan mutánsokat is vizsgált, amelyek annak függvényében termelték a lac operon fehérjéit, hogy jelen volt-e az inducer laktóz: 2 típusú upstream lac regulátor mutánst jósoltak meg: • Mutációk alac operátorban (lacO) • Mutációk a lac represszorban (lacI)

20. Mutációk a lac operátorban (lacO): Parciális diploidE. colitörzseket használtak:lac operon gének normális promóterrel a plazmidon (F’) . • Plazmid F’ lacO+ lacZ- lacY+ permeáz (csak laktózzal) • Kromoszóma C lacOc lacZ+ lacY- -galaktozidáz (laktóz nélkül is) (folyamatosan megnyilvánul, konstitutív) Következtetések: • AlacOalacZés alacYelőtt helyezkedik el és az utána következő fehérjék termelését befolyásolja ugyanazon a molekulán. • AlacOegy szabályozó DNS szekvencia; nincs diffúzóra képes géntermék. • Ha lenne diffúzióra képes géntermék, akkor laktóz nélkül is termelődne permeáz.

21. Mutációk a lac represszorban (lacI): Szintén parciális diploidE. coli F’ törzsekkel;lac operon gének normális promóterrelés normális operátorral. F’ lac I+lacO+ lacZ- lacY+ C lacI- lacO+ lacZ+ lacY- • Laktóz nélkül, nincs-galaktozidázés permeáztermelés. • Laktózzal (inducer), -galaktozidáz és permeáz szintetizálódnak. Következtetés: • lacI+represszor fehérjét kódol (diffúzióra képes termék). • Laktóz nélkül a represszor fehérje kötődik az operátorhoz és gátolja a downstream fehérjék termelődését. • Laktóz jelenlétében a represszor fehérjét gátolja az allolaktóz és a fehérjék termelődnek.

22. Mutáció lehet a promóterben is (Plac): • Gátlódhat az RNS polimeráz kötődése és nincs fehérje szintézis a struktúrgénekről, ha van laktóz, ha nincs. • Egyetlen mutáció mindhárom fehérje génjét befolyásolja,lacZ, lacY, éslacA.

23. Alac operon szerveződése a vad típusú E. coli-ban. A szabályozó elemek és a gének sorrendje: lacI: promóter-lacI-terminátor operon: promóter-operátor-lacZ-lacY-lacA-terminátor

24. AzE. colilac operon funkcionális állapota laktóz nélkül:

25. AzE. colilac operon funkcionális állapota laktózon növesztve:

26. Alac represszor modellje tetramer (4 polipetid) fehérje.

27. A Jacob-Monod féleE. colilac operon modell: • Az operon egy génklaszter; a gének megnyilvánulásást opero-represszor kölcsönhatás szabályozza. • Alac I génnek van saját gyenge promótere és terminátora;lacI represszor fehérje mindig van kis mennyiségben. • A represszor fehérje tetramer (4 polipeptid). • A represszor kötődik az operátorhoz (lacO) és akadályozza az RNS polimerázt a transzkripció iniciációjában. • A kötődés reverzibilis, így mindig van kevésLacZ, LacY, ésLacA fehérje. • Amint nagy mennyiségű laktóz kerül a tápoldatba a lac operon azonnal bekapcsol. • A laktózon növekvő vad típusúE. coli-ban a -galaktozidáz a laktózt átalakítja allolaktózzá. • Az allolaktóz kapcsolódik a represszorhoz, ezért a represszor fehérje alakja megváltozik és nem tud kötődni az operátorhoz. • Az allolaktóz indukálja a lac operon expresszióját.

28. Az RNS polimeráz egyetlen poligénes mRNS szintézisét iniciálja, a lacZ, lacY, éslacAgének mRNS-ét. • mRNSegyetlen molekulaként transzálódik riboszóma füzérrel. • A lac operon úgynevezettnegatív kontroll alatt áll (a lacIblokkolja az RNS polimerázt, ha nincs indukáló ágens) • Különböző típusú mutációk lehetnek alacO, alacI, ésa promóter régiókban: lacO -megváltozik a represszor kötőhelye (represszor nem tud kötődni) -állandó, konstitutív exszpresszió lacI -a represszor konformáció változik meg (nem tud kötődni az operátorhoz) -konstitutív -szuper-represszorköti az operátort, de az allolaktózt nem -a laktóz nem tudja indukálni az operont, nincs expresszió promóter -megváltozik affinitása az RNS polimerázhoz -növeli, vagy csökkenti a transzkripció mértékét

30. Alac operon pozitív szabályozás alatt is áll: • Pozitív a lac operon szabályozása, ha azE. coli egyedüli C-forrása a laktóz (de nem, ha glükóz is van a tápoldatban). • A katabolit aktívátor fehérjéhez (catabolite activator protein) (CAP)kötődik a cAMP, aktíválódik, és kapcsolódik a promóter előtti CAP felismerő helyhez (cAMP koncentráció nagyon kicsi glükóz jelenlétében). • CAP megváltoztatja a DNS konformációját, megkönnyítve az RNS polimeráz kötődését és a transzkripciót. • Ha glükóz és laktóz egyszerre vannak jelen, a glükózt hasznosítja először a kevés cAMP miatt nem aktíválódik elegendő CAP. (diauxiás növekedés) • Ha feleslegben adunk cAMP-ot, akkor lesz transzkripció a lac operonról, még glükóz jelenlétében is. • A LacI lokális, helyi szabályozó. • A CAP globális, máshol is ható szabályozó.

31. Alac operon pozitív szabályozása CAP-val

32. Alac operon szekvencia volt az első jól jellemzett génszabályozási modell : • A lac operon promóter -84 bp-ra kezdődik, közvetlenül alacI stop kodon utánés -8 bp-ravégződik a transzkripciós starthelytől. • CAP-cAMP kötőhelyek -54 →-58 és -65 → -69. • RNS polimeráz kötőhely -47 → -8. • Operátor a promóter mellett -3 → +21. • mRNS transzkriptum +1 bp-nál kezdődik, az operátorban. • A -galaktozidáz génnek a start kodon előtt van egy vezető szekvenciája (riboszóma kötőhely/Shine-Delgarno szekvencia) • A -galaktozidáz start kodonodon (AUG) +39 → +41

33. Lac operon szabályozó szekvenciái

34. AzE. colitriptofán operon: • Ha van aminosav a tápoldatban, akkor „importálja” az aminosavakat, mielőtt szintetizálna. • Az aminosav szintézis gének represszáltak, represszálható operonok. • Ha nincs aminosav a táptalajban, a gének „bekapcsolnak” (megnyilvánulnak) és lesz aminosav szintézis. • AzE. colitriptofán operonja az egyik legjobban tanulmányozott represszálható operon.

35. AzE. coli Trp operon; (Charles Yanofsky és mtsai.): • A Trp operon ~7kb méretű és 5, a triptofán szintézishez szükséges génterméket kódol , trpA-E. • A promóter és az operátor atrpEelőtt van. • A vezető régió (trpL) atrpA-Estruktúrgének és az operátor között helyezkedik el. • AtrpL-ben van egy attenuátor régió (att). • TrpR (represszor fehérje gén) a promóter előtt van.

36. AzE. coli Trp operon szerveződése:

37. Atrp operon szabályozása: Atrp operont két mechanizmus szabályozza: Represszor/operátor kölcsönhatás A megkezdett transzkripció attenuációja (a transzkripció megakad)

38. 1. Represszor/operátor kölcsönhatás • Ha van triptofán, akkor kötődik a trpR géntermékéhezt. • trpRfehérje kapcsolódik atrp operátorhoz és megakadályozza a transzkripciót. • A represszió ~70-edére csökkenti a trp operon transzkripciójának mértékét.

39. 2. A megkezdett transzkriptum terminációja • A transzkripciótattenuáció is szabályozza, egy rövid, nem komplett fehérje transzlálódik. • Ha a sejtek „éheznek” triptofánra, akkor a trp gének maximálisan kifejeződnek. • Kevésbé súlyos éhezés esetén, csak a maximálisnál kisebb mértékben nyilvánulnak meg. • Az attenuáció a transzkripció mértékét 8-10-szeres faktorral szabályozza; a repressziós mechanizmussal kombinálódva 560-700- szoros mértékben csökkentheti.

40. Az attenuáció molekuláris modellje: • A vezető régió (trpL) az operator és atrpE szekvenciák között van. • E vezető szekvenciában van az attenuációs régió (att). • Azattszekvenciában start kodon, 2 Trp kodon, egy stop kodon, és négy olyan szekvencia régió, amelyek három alternatív másodlagos szerkezet kialakítására képesek. • Másoglagos szerkezetSzignál • H-híd kötések 1-2 régió szünet • H-híd kötések2-3 régióantitermináció • H-híd kötések3-4 régiótermináció

41. A vezető /attenuátor trp operon szekvencia:

42. Emlékezzünk arra, hogy prokariótákban a transzkripció és a transzláció egyszerre, egy helyen. • Az mRNS 1 és 2 régiói között kialakuló H-híd kötések (hajtű, stem loop) megakasztja az RNS polimerázt, amint ez a rész szintetizálódott. • A szünet éppen elég hosszú ahhoz, hogy a riboszóma kapcsolódjon az mRNS-hez és elkezdje a transzlációt közvetlenül az RNS polimeráz mögött.

43. A riboszóma helyzetének fontos szerepe van az attenuációban: Ha a Trpkevés, vagy nincs utánpótlás (és szükséges): • Trp-tRNS-eknincsenek, a riboszóma megáll a Trpkodonoknálés lefedi az 1-es attenuátor régiót. • Az 1-es és 2-es régiók között nem tud kialakulni a hajtű szerkezet, ehelyett a 2-es régió a 3-assal alakít ki hajtűt, amint az elkészült. • A 3-as régió (most a 2-essel párban) a 4-essel nem tud kapcsolódni a szintézis után. • Az RNS polimeráz folytathatja a 4-es régió után a teljes trp mRNS szintézisét.

44. A riboszóma helyzete fontos az attenuációnál: Ha a Trp elegendő (és nem szükséges): • A riboszóma nem áll meg a Trpkodonoknálés folytatja a vezető polipeptid szintézisét, befejezve a 2-es régiónál. • A 2-es és a 3-as régiók nem képezhetnek hajtűt, ezért az a 3-as és a 4-es régió között alakul ki. • A 3-as és a 4-es régió közötti hajtű az „attenuátor” szekvencia és terminációs szignálként szolgál. • A transzkripció azelőtt fejeződik be, hogy a triptofán struktúrgéneket elérte volna az RNS polimeráz.

45. Az attenuációs modell aTrpéheztetett sejtekben.

46. Attenuáció modellje elegendőTrpjelenlétében.

47. Phe, His, Leu, Thr, ésIle operonok feltételezett attenuátorainak aminosav szekvenciáiE. coli-ban.

48. E. coli RNS ploimeráz σ kaszkád

49. Osztódási ciklus Spórázás-csírázás ciklus ? Metabolit és környezeti jelek ABacillus subtiliséletciklusa • B. subtilisspórázik, ha a környezeti feltételek kedvezőtlenné válnak

50. Különböző típusú kölcsönhatások : gének, fehérjék és kis molekulák között a B. subtilis spórázásának szabályozásánál AbrB SinR~SinI Spo0A~P aktiváljasin operont SinR H A   SinI - AbrB represszáljasin operont SinI inaktiválja SinR-t sinI sinR + Spo0A˜P sin operon Szabályozási kölcsönhatások