STRESS OSSIDATIVO

1. STRESS OSSIDATIVO Stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di un eccesso di specie chimiche reattive,generalmente centrate sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), secondarioadun’aumentata produzione delle stesse e/o a una ridotta efficienza dei sistemi fisiologici di difesa antiossidanti.

2. STRESS OSSIDATIVO Sbilanciamento dell’equilibrio tra pro-ossidanti e antiossidanti nell’organismo a favore dei pro-ossidanti PRO-OSSIDANTI ANTIOSSIDANTI

3. Ridotta assunzione e/o diminuita sintesi e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti Radiazioni, farmaci, metalli pesanti Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà Infezioni ed altre malattie Specie reattive  Difese antiossidanti  Danno cellulare Danno tissutale Danno d’organo Danno sistemico Malattie cardiovascolari Demenza, M. di Parkinson Infiammazioni, tumori Altre malattie Invecchiamento precoce Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi pro-ossidanti e processi antiossidanti (Sies, 1991)

4. Reazioni del metabolismo dell’ossigeno L’ossigeno è una molecola biatomica solitamente rappresentata come O::O In realtà alla temperatura corporea l’ossigeno è un biradicale .O : O. con due elettroni spaiati, ciascuno localizzato su un orbitale diverso. A causa quindi della sua configurazione elettronica l’ossigeno va incontro a riduzione monovalente ( 1 e-)

5. Quando un ossigeno guadagna un elettrone, si trasforma in radicale anione superossido, O2-. L’aggiunta di un secondo elettrone (insieme con due protoni) trasforma quest’ultimo in perossido di idrogeno, H2O2. Il perossido non è un radicale ma guadagna facilmente un altro elettrone dando spazio ad un radicale idrossilico, OHche è una particella chimica molto attiva che inizia facilmente reazioni a catena incontrollabili.

6. Nei sistemi biologici, i radicali liberi dell’ossigeno o ROS(Reactive Oxygen Species) vengono generati ed eliminati continuamente. I principali ROS sono: O2-(anione superossido), O2H (radicale idroperossido); OH (radicale idrossilico); NO (monossido d’azoto); ONOO- (anione perossinitrito). Esistono altre molecole, quali H2O2(perossido d’idrogeno) e HOCl (acido ipocloroso) che pur non essendo radicali di per sé, producono facilmente il radicale idrossilico, altamente reattivo

7. Elettrone spaiato OSSIDAZIONE C C C C A A + + Radicale (ossidante) Molecola bersaglio (doppio legame C-C) Nuova molecola (ridotta, stabile) Nuovo radicale (ossidante) Le specie chimiche reattive, radicaliche, agiscono come ossidanti L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o più elettroni, è la base chimica dello stress ossidativo

8. REAZIONI DI RADICALI LIBERI INIZIO: formazione di radicali liberi PROPAGAZIONE: i radicali liberi reagiscono con altre molecole per produrre altri radicali liberi TERMINAZIONE: i radicali liberi reagiscono tra loro per formare molecole

9. REAZIONI DI RADICALI LIBERI CH4 + Cl2 CH3Cl + HCl

10. Cl  Cl  Cl  Cl  INIZIO • Richiesta luce UV per questo primo stadio • Formazione di radicali liberi PROPAGAZIONE La propagazione è caratterizzata da reazioni in ciascuna delle quali si consuma un radicale libero e se ne forma un altro • Non è richiesta luce • Ogni reazione produce radicali liberi

11. H Cl  + H  C  H H H  Cl  H +  C  H H Molecole Radicali liberi H H  C  + Cl  Cl H H  H  C  Cl + Cl  H

12. H Cl  +  C  H H H  Cl  C  H H H H  C  H  C  H HH H H  H  C  C  H HH TERMINAZIONE La terminazione è caratterizzata dalle reazioni dei radicali liberi per produrre molecole Cl  + Cl   Cl  Cl

13. Diverse specie chimiche reattive sono implicate nella patogenesi dello STRESS OSSIDATIVO Specie chimica Formula Classe Specie chimica Formula Classe Ozono O3 Non radicale Ossido nitrico NO Radicale Anione superossido O2 Radicale Acido nitroso HNO2 Non radicale Ossigeno singoletto 1O2* Radicale (?) Tetrossido nitrico N2O4 Non radicale Perossido di idrogeno H2O2 Non radicale Triossido nitrico N2O3 Non radicale Radicale ossidrile HO Radicale Perossinitrito ONOO- Non radicale Radicale alchilico R Radicale Acido perossinitroso ONOOH Non radicale (Alchill-)perossil radicale ROO Radicale Catione nitronio NO2+ Non radicale (Alchil)idroperossido ROOH Non radicale (Alchil)perossinitrito ROONO Non radicale Semichinone (dal Coenz. Q) Q Radicale Acido ipocloroso HOClO Non radicale Fenossile (dalla vitamina E) E-O Radicale Tiile -S Radicale

14. I ROS vengono prodotti sia attraverso una serie di reazioni catalizzate da enzimi che attraverso reazioni di natura non enzimatica. I ROS possono essere prodotti anche in seguito ad esposizione a radiazioni ionizzanti, xenobiotici, agenti chemioterapici.

15. reazione di Fenton: H2O2 + Fe2+ (Cu+ ) Fe3+(Cu2+) + HO + OH- reazione di Haber-Weiss: H2O2 + O2-HO+ OH- + O2 Il perossido di idrogeno in presenza di ioni Fe2 + o Cu2+ reagisce con l’anione superossido prendendo parte alla:

17. I mitocondri vengono considerati la fonte principale di ROS cellulari poiché i radicali del superossido vengono generati costantementedurante la fosforilazione ossidativa e possono essere convertiti in H2O2 ed altre specie reattive dell’ossigeno Durante i processi di fosforilazione ossidativa, il 4-5% dell’ossigeno non viene completamente ridotto ad H2O, ma forma prodotti intermedi dell’O2 altamente reattivi

18. Nella cellula, i ROS oltre che nei mitocondri, vengono generati anche in altri compartimenti e da molti enzimi.

19. NADPH ossidasi Lipoossigenasi NADH deidrogenasi Citocromo ossidasi Stress ossidativo da modificazioni reattive della superficie cellulare Stress ossidativo da ridotta efficienza del- la respirazione cellulare Xantina ossidasi Aldeide ossidasi Citocromo P450 Citocromo b5 Stress ossidativo da variazioni intracellulari della pO2 Stress ossidativo da induzione farmacometabolica Numerose attività metaboliche sono in grado di generare ROS NADPH ossidasi Lipoossigenasi NADH deidrogenasi Citocromo ossidasi Xantina ossidasi Aldeide ossidasi Citocromo P450 Citocromo b5

20. xantina xantina Acido urico ipoxantina Xantina ossidasi H2O + O2 O2 H2O2 O2. Meccanismo d’azione della NADPH ossidasi Produzione di ROS dal catabolismo purinico

21. Biosintesi dell’NO Agisce come importante messaggero intra ed inter cellulare regolando molte funzioni: pressione arteriosa, respirazione, coagulazione del sangue ed alcune attività cerebrali. Ha un ruolo determinante nella difesa dalle infezioni batteriche e nella prevenzione dei tumori

22. MECCANISMI DI PRODUZIONE DI ROS Negli organismi viventi i ROS sono generati nel corso della normale attività metabolica cellulare

23. A concentrazioni elevate i ROS sono dannosi per l’organismo in quanto attaccano i maggiori costituenti della cellula (proteine, acidi nucleici, lipidi) partecipando così a processi complessi quali l’invecchiamento e le patologie ad esso correlate. A concentrazioni moderate i ROS partecipano attivamente ad una varietà di processi biologici complessi, implicati nella normale crescita cellulare quali la trasduzione del segnale, il controllo dell’espressione genica, la senescenza cellulare, l’apoptosi

24. Effetto dei ROS sulle macromolecole I ROS causano danni ossidativi, chimici alle biomolecole Il radicale idrossilicoOH reagisce con le biomolecole tramite reazioni di sottrazione o addizione di H. Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi Il radicale idrossilicoOH reagisce con vari amminoacidiper formare derivati idrossilati Il radicale idrossilicoOH reagisce con le basi azotate I ROS reagiscono anche con icarboidratiper formare composti dicarbonilici

25. La matrice cellulare rappresenta uno dei principali target delle specie reattive dell’ossigeno Il danno della matrice extracellulare gioca un ruolo determinante nella patogenesi dello stress ossidativo

26. Gli effetti dello stress ossidativo sulla struttura e sulle funzioni cellulari Perossidazione di lipidi Modificazioni enzimatiche Perossidazione ammi- noacidi e proteine Modificazioni del DNA (Per)ossidazione di carboidrati Denaturazione di proteine Cellula dopo l’attacco dei ROS Cellula normale (senza lesioni) Alterazioni della omeostasi ionica

27. Effetto dei ROS sulle macromolecole Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi. Il radicale idrossilicoOH sottrae un atomo di idrogeno ad un acido grasso poliinsaturo, iniziando così una catena di reazioni di perossidazione lipidica. I perossidi lipidici formati in questa reazione vengono degradati per formare dei prodotti caratteristici quali la malonildialdeide (MDA) o l’idrossinonenale (HNE) Questi composti reagiscono con le proteine formando legami crociati e addotti chimici con esse (prodotti finali di lipoossidazione avanzata)

28. DANNO INDOTTO DALLA LIPOPEROSSIDAZIONE ALLE MEMBRANE BIOLOGICHE

29. perossidazione dei PUFA (acidi grassi polinsaturi) RADICALI LIBERI ridotta fluidita’ di membrana compromessa attività cellulare NEOPLASIE INVECCHIAMENTO MALATTIE CARDIOVASCOLARI

30. Effetto dei ROS sulle macromolecole Il radicale idrossilicoOH reagisce con vari amminoacidiper formare derivati idrossilati H2O2 e HOCl e ONOO- reagiscono con la metionina e la tirosina per formare nitro-e-clorotirosina e metionina solfossido

31. Effetto dei ROS sulle macromolecole Il radicale idrossilicoOH reagisce con le basi azotate. I maggiori prodotti dell’ossidazione sono la 8-ossiguanosina (il principale indicatore di danno al DNA), timinaglicole, 5-idrossimetiluracile

32. RADICALI LIBERI E ACIDI NUCLEICI

33. EFFETTI DEI RADICALI LIBERI NEI SISTEMI BIOLOGICI

34. Difese antiossidanti Per evitare i danni ossidativi, la cellula ha sviluppato un sofisticato sistema di difesa nei confronti dei ROS di natura enzimaticae non(attività “scavenger”). Tali meccanismi di difesa sono fondamentali per l’omeostasi redox cellulare che dipende dal bilancio tra generazione dei ROS e sistemi antiossidanti. Quando l’equilibrio si sposta a favore dei primi oppure la cellula si trova in uno stato di carenza di difese antiossidanti si crea la condizione di stress ossidativo. I principali enzimi responsabili dell’omeostasi redox cellulare sono: la superossido dismutasi (SOD) la catalasi la glutatione perossidasi la tioredossina la perossiredossina Questi enzimi funzionano come “scavengers” dei ROS, ma non possono intervenire direttamente sulle macromolecole biologiche a rimuovere un danno già avvenuto.

35. Il sistema antiossidante è regolarmente distribuito nella cellula

36. ANTIOSSIDANTI ENDOGENI Enzimi: SOD, catalasi, glutatione perossidasi Proteine: proteine-SH, leganti metalli (Fe, Cu) Altre molecole: acido urico, bilirubina ... ESOGENI • Non vitaminici: • Carotenoidi • Polifenoli • Vitaminici: • Vitamina C • Vitamina E • Carotenoidi (b-carotene)

37. Meccanismo d’azione degli antiossidanti Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti, farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, … Antiossidanti preventivi Bloccano la formazione dei radicali Specie Chimiche Reattive Bloccano la reazione di inizio Antiossidanti scavenger Attacco di biomolecole (glicidi, lipidi, proteine, ecc) Bloccano la reazione di propagazione Reazioni radicaliche a catena Antiossidanti di riparo e de novo Riparano il danno e ricostituiscono le membrane Danno ossidativo Invecchiamento, malattie

38. ANTIOSSIDANTI PREVENTIVI Prevengono la formazione dei radicali liberi

39. ANTIOSSIDANTI SCAVENGER • Riducono la concentrazione di radicali liberi rimuovendoli dal mezzo in cui si trovano • Natura idrofila: albumina, acido urico, vitamina C • Natura lipofila: carotenoidi, vitamina E, coenzima Q

40. AGENTI DI RIPARO • Enzimi che intervengono dopo il danno effettuato dai radicali liberi • Idrolasi, transferasi, polimerasi AGENTI DI ADATTAMENTO • Sostanze o tecniche attraverso le quali è possibile potenziare il sistema antiossidante fisiologico di un organismo • esercizio fisico, regime alimentare corretto ed equilibrato

42. ANTIOSSIDANTI ENDOGENI ENZIMATICI, CELLULARI SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD) • Principale antiossidante cellulare, mantiene bassa la concentrazione di anione superossido (O2-• ) • Converte l’anione superossido in perossido d’idrogeno • Agisce in collaborazione con la catalasi e la glutatione perossidasi

43. La superossido dismutasi (SOD)

44. La SOD catalizza la reazione di dismutazione dell’anione superossido: 2 O2- + 2H+  H2O2 + O2 Se ne conoscono varie forme isoenzimatiche. Nei mitocondri l’isoenzima utilizza come cofattore il manganese (MnSOD). Altri isoenzimi, di cui alcuni anche a localizzazione nucleare hanno come cofattori rame o zinco (Cu/ZnSOD). Esiste anche un isoenzima Cu/ZnSOD extracellulare secreto (EC-SOD) La catalasi (appartiene alla classe delle ossido-reduttasi), localizzata nei perossisomi,inattiva l’H2O2catalizzando la reazione: 2H2O2 O2 + 2H2O contiene un gruppo eme

45. ANTIOSSIDANTI ENDOGENI ENZIMATICI, CELLULARI CATALASI (CAT) 2 H2O2 2 H2O + O2 • Eme-proteina presente nei perossisomi e nel citosol degli RBC • Agisce con la SOD per la rapida detossificazione dell’anione superossido (O2-•)

46. PEROSSIDASI (Px) • Diverse forme, diverse localizzazioni, diversi substrati • Difesa cellulare primaria contro i perossidi (R-OOH, H2O2) • Convertono i perossidi in H2O in presenza di riducenti R-OOH + AH2 R-OH + A + H2O

47. La glutatione perossidasi

48. ANTIOSSIDANTI ENDOGENI ENZIMATICI, CELLULARI GLUTATIONE PEROSSIDASI (GSH-Px) 2 H2O2 2 H2O + O2 ROOH ROH + H2O 2 GSH GSSG GLUTATIONE REDUTTASI NADP+ NADPH2 • Richiede selenio (cofattore) e glutatione (riducente)

49. GLUTATIONE (GSH) • Tripeptide (Glu-Cys-Gly) endogeno idrofilo a basso PM • Cofattore della glutatione-perossidasi (GPx) • Consente alla GPx di svolgere il suo ruolo antiossidante

50. GLUTATIONE (GSH) • Azione disintossicante • Attività immunitaria • Attività protettiva nei riguardi del SNC E’ presente in alimenti quali: cocomero, avocado, asparagi, pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, spinaci.