主讲 . 沈文飙 2006.03.14 生物化学与分子生物学系

1. NO抑制拟南芥花的转换Nitric oxide represses the Arabidopsis floral transitionScience, 2004, 305Pei ZM et al. 主讲.沈文飙 2006.03.14 生物化学与分子生物学系

2. 主要内容： • 拟南芥花的转换 • 信号分子一氧化氮 • 一氧化氮与拟南芥花的转型 • 开花研究展望

3. 1.拟南芥花的转型 • 正确的开花时间是植物最大量繁殖成功所必需的，并且由环境和内源信号控制。 • 开花植物的生命周期由两个重要部分组成，起始营养阶段（分生组织形成叶）和随后的生殖阶段（分生组织形成花）。拟南芥的开花时间的基因研究显示四个主要路径。

4. 拟南芥的开花控制主要路径的相互关系

6. 2.信号分子一氧化氮 • NO在动物中扮演关键角色，而且在植物中也是关键的生长调节物质。NO促进叶子的伸张，延缓成熟和衰老，刺激依赖光的萌发和阻止黄化。在烟草植物中过量的内源NO减缓生长和发育。 • NO的诱导生成有生物和非生物途径，例如干旱，盐胁迫和病原菌等。另外，过量的NO从植物中释放的大气中，相反的，大气中NO作为主要的温室污染物（来自石油的燃烧）也能影响植物。 • 因此，NO和环境条件相协调在植物生长和发育的过程中起重要作用。

7. 3.一氧化氮与拟南芥花的转型 1）.外源NO促进植物生长，抑制生殖发育。 • NO供体SNP处理的 拟南芥种子生长加快，开花延迟 （图示）。 • 拟南芥种子放置于培养皿中在16h/8h的光暗周期比下用SNP培养5周。

8. 不同SNP浓度对芽生长的影响 芽的鲜重 玫瑰叶的数目 抽苔所需天数

9. 通过观察玫瑰叶的数目和抽苔（在成花时快速向上生长）需要的天数，发现SNP对开花有延迟作用有浓度依赖性。通过观察玫瑰叶的数目和抽苔（在成花时快速向上生长）需要的天数，发现SNP对开花有延迟作用有浓度依赖性。 • 开花时间判断的标准是在第一朵花形成之前主芽上的叶子数目（开花越迟的植物叶子越多）。

10. 2）.内源NO抑制花的转型 • 外源供给的NO无法拥有内源的NO所具有的功能 • 对内源NO水平被改变的突变体的分析被用于确定体内的NO水平。 • 植物组织中NO的定量使用NO敏感染料（DAF-2-DA）测量。

11. 我们使用NO敏感性（对根生长的抑制作为指标）来筛选nox突变体（上调NO释放的突变体）。其中nox1可以为研究NO功能提供很大的帮助。我们使用NO敏感性（对根生长的抑制作为指标）来筛选nox突变体（上调NO释放的突变体）。其中nox1可以为研究NO功能提供很大的帮助。

12. 在nox1突变株中根的生长状况，nox1过量生成NO。在nox1突变株中根的生长状况，nox1过量生成NO。

13. 在nox1和WT中内源NO的水平。叶子用 DAF-2DA染色，荧光的激发波长为490nm,发射波长515nm，使用相同的曝光时间（光 镜照片如 下）。

14. A D E B C H F G J I Fig. 3. Visualization of NO in cross sections from the basal part of mung bean hypocotyl cuttings treated with CO, Hematin and cPTIO by laser scanning confocal microscope using DAF-2DA (A) CK for 0 h, (B) CK for 12 h, (C) CK for 36 h, (D) CK for 48 h, (E) CK for 60 h, (F) Hematin (10 μmol/L) for 36h, (G) CO gas aqueous solution with 100.0% saturation for 12 h, (H) CO gas aqueous solution with 100.0% saturation for 36 h, (I) CO gas aqueous solution with 100.0% saturation for 48 h, (J) CO gas aqueous solution with 100.0% saturation for 60 h, (K) CK for 36 h and then 500 μmol/L cPTIO, (L) Hematin (10 μmol/L) for 36 h and then 500 μmol/L cPTIO, (M) CO gas aqueous solution with 100.0% saturation for 36 h and then 500 μmol/L cPTIO. Upper and down lane of each treatments were pictures examined by laser scanning confocal microscope and corresponding bright-field images. V, vascular bundles. Bar=100 µm K L M

15. 3).NOX1与CUE1的关系 • 基于Map-based cloning的分析表明NOX1与CUE1接近或一致 。 • NOX1形态学上的表型形（植物较小，叶子发白不成熟﹑网状）也与叶绿素a/b结合蛋白（CAB）少量表达的cue1突变体（编码叶绿体磷酸烯醇丙酮酸/磷酸转运器）几乎相同。 • CUE1突变株对SNP高度敏感并且显示提高的内源NO水平。

16. cue1不能达到nox1的显型水平 在所有的六个nox1等位基因中，删除CUE1基因。因为NO是L-Arg在NOS的作用下转变为L-Cit时产生，所以cue1突变体的自由L-Arg和L-Cit比WT的高好几倍，导致nox1过量分泌NO。我们有充分理由认为CUE1基因的中断会增加内源的L-Arg浓度，进一步转变成NO。

17. 由此可见，具有专一氨基酸突变的nox1和cue1-5突变株确实比WT含有更多的L-Arg，L-Cit和NO，表明依赖于NOS的NO生成确实 存在于拟南芥中。

18. 土壤中生长的nox1和cue1突变体开花较迟 nox1在各种光下开花都很迟，但是这种现象并不严格依赖于光周期。

19. 上述现象严格地受到一定光周期的影响，当光照和黑暗时间比为16/8，12/12和8/16时植物叶子的数量分别增加18%, 61%, and 17% ，与cue1突变体中表现出的依赖于光 的现象一致。

20. 4).内源NO的下调促进花的转型 • 生成较少量NO的Atnos1 (nos1)突变体开花比WT早。但是对SNP依然敏感 ，表明NO在控制花的转型中担当特殊的角色。

22. 拟南芥的开花控制主要路径的相互关系

23. 5).NO调控控制花转型的基因的表达 • NO分别对LFY表达的影响。 花分泌组织特性基因LEAFY (LFY)花形成起始时的重要决定基因，它的表达在开始开花时呈规律性增长。

24. SNP抑制LFY的表达对浓度有依赖性。LFY在nox1中表达比WT低，但在nos1植物中的含量与WT比高。LFY和内源NO之间的关系暗示NO部分的通过LFY介导对花的转型的抑制作用。SNP抑制LFY的表达对浓度有依赖性。LFY在nox1中表达比WT低，但在nos1植物中的含量与WT比高。LFY和内源NO之间的关系暗示NO部分的通过LFY介导对花的转型的抑制作用。

25. 拟南芥的开花控制主要路径的相互关系

26. 基因易位显性分析NO和GA、自动途径 的关系 • nox1突变株开花迟且植株较小，与GA缺失体的形状相同。GA促进nox1和WT的开花但不能逆转nox1矮小的性状，这表明NO和GA在功能上可能是平行的。

27. nox1和自动途径的突变株长光照和短光照开花都迟，我们认为nox1可能影响此通路。由于自动通路通过FLOWERING LOCUS C (FLC)（开花抑制基因），而自动途径的开花延迟的突变株常常表达大量的FLC。

28. 拟南芥的开花控制主要路径的相互关系

30. 低浓度的SNP（≤50µM）处理可以减少FLC的表达，高浓度的SNP（>50µM）恰恰相反，FLC的表达在nox1比WT高，但在nos1含量比WT略低。低浓度的SNP（≤50µM）处理可以减少FLC的表达，高浓度的SNP（>50µM）恰恰相反，FLC的表达在nox1比WT高，但在nos1含量比WT略低。

31. 然而，用高剂量NO处理的WT植株或nox1的开花延迟现象可能是通过对FLC的上调，也可能是由独立于FLC的成分导致。虽然如此，nox1﹑WT和nos1的开花性状与FLC的表达量相一致，表明内源NO可能下调自动途径，导致开花延迟。

32. 6).NO调节光周期通路 • 先前的研究已经说明NO作用于植物依赖于光照，而cue1突变株显示各种光形态建成和光感知上的缺陷 . • 拟南芥是一个长光照植物，长光照促进开花。CONSTANS (CO)是目前为止遗传学上通路鉴别最下游的成分，它促进开花感应并且也是生理周期和开花调控的联结点。

33. 拟南芥的开花控制主要路径的相互关系

35. SNP抑制CO有剂量效应，CO的表达在nos1中比WT高，但在nox1比WT还要低。SNP抑制CO有剂量效应，CO的表达在nos1中比WT高，但在nox1比WT还要低。

36. CO的表达呈现一日间的节律，因此NO对CO的抑制可以归因于周期的缩短或一阶段的变速，也许两者皆有。CO的表达呈现一日间的节律，因此NO对CO的抑制可以归因于周期的缩短或一阶段的变速，也许两者皆有。 • 为了确定NO的这种作用，我们测定了一个12h光照/12h黑暗周期光照下CO mRNA的表达 。

37. 尽管CO mRNA水平的状态没有被很严重的扰乱，全部的CO mRNA丰度在nox1中比WT低，在nos1中高，与先前光周期通路突变株gigantea (gi)和 early flowering 3 (elf3)的研究结果一致。

38. gi损伤下调CO表达，导致较晚开花，反之elf3损伤上调CO表达促进开花。gi损伤下调CO表达，导致较晚开花，反之elf3损伤上调CO表达促进开花。 • 我们通过分析CO上游GIGANTEA (GI)检测NO是否直接作用于CO表达。与CO相似，GI mRNA丰富的周期在nox1中比WT低，暗示NO作用在CO上游。

39. 另外，我们分析了对NO响应的elf3和CO过量表达植物(35S::CO)的开花性状，在elf3突变株和(35S::CO，提高CO丰度，开花早)植株中NO对开花的抑制被大量的解除，进一步证实了NO在光通路中的角色 。

40. 7).NO影响生理时钟 • CO表达由生理周期和光周期调控，CAB表达的生理周期可以表现植物中的节律钟控。 • 将12h/12h的光暗周期改变为15h/9h后CAB mRNA含量的丰度在nox1中和在cue1突变株中一样大量减少，但是昼夜节律的状态并没有改变，这又与CO和GI的表达相似。

41. 子叶叶片的运动（另一个周期产量的丰度）在nox1中比WT下降43.8 ± 4.9%，而且生理周期的时间没有改变 。子叶的运动在恒定的暗光下纪录。

42. 生理周期时钟中枢振荡器的成分TIMING OF CAB EXPRESSION (TOC1) 和CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1)表达的生理周期的时间和产量在nox1中都没有改变，因此更加验证NO可能影响生理输出而非中枢振荡器。 • 另外，对于WT，处于12h/12h的光暗周期的叶子中NO的含量午夜时是中午时的70.6%，对于nox1则为58.0%，暗示内源NO水平显示一个一日间的节律，与之前的结果一致。尽管NO的生成是否依赖光或生物钟还不清楚，但在nox1种动态平衡下的变动可能引起它的开花状态。

43. 4.开花研究展望 • 我们通过药理学﹑生理学﹑分子和基因数据证明NO抑制光周期和自动（治）开花通路，和先前观察到的抑制烟草生长的结果大量相似，过量生成的NO会延缓成熟和衰老。 • 假设NO和构成生成一样由环境变化诱导，内外因素可能共同调节内源的NO状态，进而传递这些信号到控制花转型的调节网络，调节网络提供一个独一无二的花发育的调控层。

44. 除了CCA1和TOC外，振荡NO水平可能为测定光照/黑暗转变提供了一个机制：作用于光信号的下游调控某一个生理周期的产量因而控制花的转型，但是NO精确的行为还需要被检测。除了CCA1和TOC外，振荡NO水平可能为测定光照/黑暗转变提供了一个机制：作用于光信号的下游调控某一个生理周期的产量因而控制花的转型，但是NO精确的行为还需要被检测。 • 因为被NO影响的多个基因（CAB, CO和GI）都由光调控，所以NO的主要作用于光信号，对开花的作用其次。从而，对NO直接靶位点的鉴定将加深我们对植物中NO的分子功能的理解。