1 / 32

FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK Buday László

FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK Buday László. TAP-CÍMKE FEHÉRJE TISZTÍTÁS. -- az eljárást Rigaut és mtsai fejlesztették ki (Nature Biotechnology, 1999, 17:1030-1032) -- http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/seraphin/TAP.html -- TAP = tandem affinity purification

coty
Télécharger la présentation

FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK Buday László

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ TECHNIKÁK Buday László

  2. TAP-CÍMKE FEHÉRJE TISZTÍTÁS -- az eljárást Rigaut és mtsai fejlesztették ki (Nature Biotechnology, 1999, 17:1030-1032) -- http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/seraphin/TAP.html -- TAP = tandem affinity purification -- a vizsgálandó fehérje mellé két „tag-ot” v. címkét helyezünk (akár C- akár N-terminálisan), melyek a protein A IgG-kötő részét, illetve egy calmodulin -kötő peptidet (CBP) jelentik -- ezeknek a címkéknek a segítségével jó hatásfokkal lehet a vizsgálandó fehéréjét, illetve fehérje komplexeit izolálni

  3. CBP protein A vizsgálandó fehérje vagy doménje TAP-CÍMKÉVEL JELÖLT FÚZIÓS FEHÉRJE FELÉPÍTÉSE TAP-címke asszociálódó fehérje TEV proteáz hasítási helye

  4. TAP-CÍMKE TISZTÍTÁSI STRATÉGIA TAP-címkével jelölt fehérjét tartalmazó sejt vagy állat előállítása Sejtkivonat előállítása TAP fehérje tisztítás SDS-poliakrilamid Funkcionális analízis gélelektroforézis (pl. enzimaktivitás mérés) Fehérje azonosítás (pl. tömeg-spektroszkópiával)

  5. TANDEM AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA KIVITELEZÉSE sejtkivonat TEV proteáz IgG oszlopról eluált fehérjék EGTA Ca2+ Kalmodulin gyantát tartalmazó kromatográfiás oszlop IgG gyantát tartalmazó kromatográfiás oszlop IgG IgG Kalm. Kalm. átfolyó fehérjék fehérjék eluálása átfolyó fehérjék fúziós fehérjénk eluálása CBP CBP prot. A CBP CBP fehérje fehérje fehérje fehérje

  6. TAP-TAG-Vav2 EXPRESSZIÓJA Cos7 SEJTEKBEN Anti-nyúl másodlagos ellenanyag + HRP TAP-TAG-Vav2 111 80 61 49 kontrol Vav2 plazmid plazmid

  7. TAP-TAG-VAV2 TISZTÍTÁSA COS7 SEJTEKBŐL 173 TAP-TAG-VAV2 111 80 61 kb. 108 tranziensen transzfektált COS7 sejtből izoláltuk a TAP-tag Vav2-t ( 3 db 15 cm-es Petri-csésze) Festés: colloidális Commassie-kék 49 36 kontrol Vav2 plazmid plazmid

  8. ÉLESZTŐ KÉT-HIBRID MÓDSZER Alapelve: a legtöbb eukarióta transzkripciós faktor két fehérje doménből áll: DNS-kötő domén (DKD) aktivátor domén (AD) A DNS-kötő domén a specifikus promóter szekvenciákhoz kötődik, míg az aktivátor domén az RNS polimeráz II-t viszi a promóter részhez Fontos: a két domén csak együtt tud transzkripciót elindítani, viszont megőrzik aktivitásukat, ha más fehérjével fúzionáltatjuk őket Transzkripciós Faktor (TF) pl. GAL4 polimeráz AD DKD transzkripció Reporter gén TF-kötő DNS promóter szakasz

  9. MI TÖRTÉNIK, HA A TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR KÉT DOMÉNJÉT KETTÉVÁGJUK, S EGY-EGY PLAZMIDDAL JUTATJUK BE A CÉLSEJTBE? Plazmid II., mely az AD-t tartalmazza Plazmid I., mely DKD-t tartalmazza polimeráz AD DKD transzkripció Reporter gén TF-kötő DNS promóter szakasz

  10. A TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR KÉT KETTÉVÁGOTT DOMÉNJÉHEZ KÜLÖN-KÜLÖN TETSZŐLEGES FEHÉRJÉKET LEHET KÖTNI Plazmid II., mely az AD-t és egy expressziós könyvtár génjeit tartalmazza Plazmid I., mely DKD-t és egy csali- fehérje génjét tartalmazza polimeráz AD csali fehérje könyvtár DKD transzkripció Reporter gén TF-kötő DNS promóter szakasz

  11. HA A CSALIFEHÉRJE KÖTŐDNI TUD AZ EXPRESSZIÓS KÖNYVTÁR EGYIK FEHÉRJÉJÉHEZ, AKKOR MEGINDUL A TRANSZKRIPCIÓ Plazmid II., mely az AD-t és egy expressziós könyvtár génjeit tartalmazza Plazmid I., mely DKD-t és egy csali- fehérje génjét tartalmazza polimeráz AD csali fehérje könyvtár DKD transzkripció Reporter gén TF-kötő DNS promóter szakasz

  12. cDNS expressziós könyvtár egyes klónjai petri csészén A pirossal jelzett klónokban a csali fehérje kötődni tudott az éppen az abban a klónban expresszálódó fehérjéhez, s a riporter gén „megszólalt” Izolálni kell a kiválasztott klónt, s szekvenálni a benne lévő cDNS darabot

  13. GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ (GST) EXPRESSZIÓS RENDSZER --- Tetszőleges fehérje, vagy fehérje domén nagy mennyiségben E. coli-ban történő expresszálására Polilinker v. Multicloning site Lac promóter IPTG GST Represszor fehérje pGEX Lac inhibitor gén Ampicillin rezisztencia gén Ori

  14. GST és X FEHÉRJÉT TARTALMAZÓ VEKTOR Lac promóter X vizsgálandó fehérje génje GST X FEH. GST pGEX GST FÚZIÓS FEHÉRJE Ampicillin rezisztencia gén Ori

  15. GST-X FÚZIÓS FEHÉRJE TISZTÍTÁSA BAKTÉRIUMBÓL AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL X FEH. GLUTATION A baktérium kivonatához glutationt adunk, mely kovalensen van kötve valamilyen gyantához Enzim-szubsztrát kölcsönhatás Ha megmossuk a gyantát akkor a bakteriális fehérjéket el lehet távolítani GST GLUTATION Sepharose matrix X FEH. GST GLUTATION GLUTATION GST X FEH.

  16. GST-FÚZIÓS FEHÉRJE ELUÁLÁSA AZ OSZLOPRÓL NAGY FELESLEGBEN ADOTT SZABAD GLUTATIONNAL TÖRTÉNIK GLUTATION GLUTATION GLUTATION GLUTATION X FEH. GST GLUTATION GLUTATION Sepharose matrix GLUTATION GLUTATION X FEH. GST GLUTATION GLUTATION GLUTATION A felesleges glutation dialízissel lehet eltávolítani. GLUTATION

  17. X-FEHÉRJE EMÉSZTÉSE A GST FEHÉRJÉRŐL Trombin hasítási hely található a GST és a X fehérje között. X FEH. GLUTATION GST GLUTATION Sepharose matrix X FEH. X FEH. GST GLUTATION GLUTATION X FEH. GST X FEH.

  18. PÉLDA A GST-FEHÉRJÉK ALKALMAZÁSÁRA FEHÉRJE-FEHÉRJE INTERAKCIÓK KAPCSÁN Korábban kimutattuk, hogy az NCK kapcsoló fehérje megköti a dinamint. Utóbbi fehérjének fontos szerepe van számos receptor down-regulációjában, illetve az endocitózisban. SH3 SH3 SH3 SH2 NCK szerkezete ? ? ? dinamin A dinamin képes az NCK egyik SH3 doménjéhez kötődni, de melyikhez?

  19. PCR SEGÍTSÉGÉVEL ELKÉSZÍTETTÜK AZ EGYES SH3 DOMÉNEKET TARTALMAZÓ GST FÚZIÓS FEHÉRJÉKET Nck SH3-1 SH3-2 SH3-3 SH2 GST SH3-1 SH3 domének PCR-e GST SH3-2 GST SH3-3 pGEX SH3-1 SH3-2 SH3-3

  20. AZ EGYES GST-SH3 DOMÉN FEHÉRJÉK TISZTÍTÁS UTÁNI KÉPE Az egyes SH3 doméneket tartalmazó GST fúziós fehérjéket Glutation-Sepharoz affinitás oszlopon megtisztítottuk, majd a GST fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk. A fehérjéket Coomassie-kék festékkel tettük láthatóvá. Nck SH3-1 SH3-2 SH3-3 SH3-1 SH3-2 SH3-3

  21. A DINAMIN AZ NCK HARMADIK SH3 DOMÉNJÉHEZ KÖTŐDIK Anti-dinamin Western-blot Kísérlet rövid leírása: Az elkészített GST-SH3 doméneket Glutation-Sepharose gyantám hagytuk a tisztítást követően. A gyantákat sejtkivonatba mártottuk, majd alaposan megmostuk, s anti-dinamin Western-blottal vizsgáltuk, hogy melyik SH3 domén köti a dinamint.

  22. ZÖLD FLUORESZKÁLÓ FEHÉRJE RENDSZER (Green fluorescence protein, GFP) -- egy medúza fajból izolált természetes fluoreszkáló fehérje -- pontmutációk segítségével fokozni lehet a fluoreszcenciát (EGFP = enhanced green fluorescence protein) -- a vizsgálandó fehérje N- és C-terminálisához egyaránt hozzá lehet fűzni -- lehetőséget biztosít a vizsgálandó fehérje élő sejten belüli követésére -- a GFP rendszer kimeríti mind expressziós rendsz, mind a riporter rendszer, mind az epitóp-címkézés fogalmát, ugyanis kiváló mono- lonális ellenanyag kapható a GFP rész ellen GFP vizsgálandó fehérje

  23. pEGFP vektorok (Clontech cégtől) N-terminális GFP C-terminális GFP GFP fehérje fehérje GFP

  24. GFP-Vav2 EXPRESSZIÓJA ÉS HATÁSA AZ AKTIN CITOSZKELETONRA COS7 SEJTEKBEN GFP TRITC- Phalloidin TRITC- Phalloidin GFP-Vav2

  25. GFP FÚZIÓS FEHÉRJÉKKEL ELKERÜLHETŐ A WESTERN-BLOTTAL VALÓ MUNKA ugyanis a gélt elég floureszcencát mérni tudó Gél-dok rendszerbe beletenni: a GFP fehérjék világítani fognak SDS-poliakrilamid gélelektoforézis

  26. FAR-WESTERN-BLOT TECHNIKA A hagyományos Western-blot eljárás módosított változata, mely fehérje- fehérje interakciók kimutatására szolgál. Lényege: a fehérje elegyet a szokásos módon SDS-poliakrilamid gél- elektroforézis segítségével elválasztjuk, majd a fehérjéket membránra (PVDF, nitrocellulóz) blottoljuk át. Itt azonban nem az átblottolt fehérjéket mutatjuk ki elsődleges, illetve másodlagos ellenanyagok hozzáadásával, hanem a blottolást követően egy szolubilis fehérjével inkubáljuk a membránt, ami kötődik az általa felismert fehérjékhez. Ez után a szolubilis fehérje elleni elsődleges, majd másodlagos ellen- anyagok segítségével detektálhatjuk azokat a membránhoz-kötött fehérjéket, melyekhez a szolubilis fehérje kikötődött.

  27. FAR-WESTERN-BLOT MENETE blottolás Nitrocellulóz membrán SDS-PAGE gél

  28. INKUBÁLÁS SZOLUBILIS FEHÉRJÉVEL Kötődik az egyik fehérjéhez a membránon Nitrocellulóz membrán

  29. A SZOLUBILIS FEHÉRJE KIMUTATÁSA ELLENANYAGOKKAL Inkubálás másodlagos ellenanyaggal Inkubálás elsődleges ellenanyaggal torma peroxidáz

  30. KO-IMMUNPRECIPITÁCIÓS TECHNIKA A legtöbb fehérje a sejtben más fehérjékhez kötve helyezkedik el. Ha a komplex egyik fehérjéje ellen termelt ellenanyaggal immun- precipitáluk a fehérjét, megfelelő körülmények között a komplex többi tagja is immunprecipitálódni fog. B A Sepharose gyanta C Protein A anti-C elleni ellenanyag

  31. PÉLDA A KO-IMMUNPRECIPITÁCIÓRA EGF receprtor Grb2 P SH3 SH2 SOS SH3

More Related