Directora: M.Sc. M ónica Jadán Codirector : Ing. Pedro Romero

1. ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA BIOTECNOLOGÍA-CULTIVO DE TEJIDOS “ Evaluación de la actividad hormonal de: Thidiazuron (TDZ), Thidiazuron con ácido α-naftalen acético (TDZ/ANA) Vs. 6 – Bencil amino purina (BAP), 6 – Bencil amino purina con ácido α-naftalen acético (BAP/ANA); como inductores de brotes en la etapa de multiplicación a partir de yemas apicales de Balsa (Ochroma lagopus).” Previo a la obtención de título de Ingeniero en Biotecnología Directora: M.Sc. Mónica Jadán Codirector: Ing. Pedro Romero Autor: David Dávila A. Sangolquí, 09 de Diciembre 2011

2. OBJETIVO GENERAL • Estandarizar métodos de micropropagación para la obtención de clones viables de plantas de Balsa (Ochroma lagopus) mediante su cultivo in vitro. • OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Establecer protocolos de: establecimiento, multiplicación y enraizamiento de Balsa (Ochroma lagopus). • Evaluar los métodos estandarizados de cultivo y micropropagación in vitro de Balsa (Ochroma lagopus). • Obtener plántulas de Balsa (Ochroma lagopus) para su uso potencial en la industria maderera.

3. Marco teórico

4. Clasificación taxonómica Nombre científico: Ochroma lagopus Género: Ochroma Familia: Bombacaceae Orden: Malvales Clase: Magnoliopsida División/Phylum: Magnoliophyta Reino: Plantae

5. Distribución natural de la balsa, Ochroma lagopus, en el neotrópico. Fuente: Tomado de K. Francis, John, 2002

6. Justificación del Problema

7. Justificación del Problema

8. Cultivo in vitro • Sobre una superficie pequeña. • Optimización de las condiciones ambientales. • Elimina por completo la presencia de microorganismos y organismos patógenos o plagas.

9. Etapas del cultivo in vitro

10. Hipótesis El Thidiazuron TDZ y el Thidiazuron con el ácido α-naftalen acético (TDZ/ANA), es el mejor inductor de brotes en la etapa de multiplicación a partir de yemas apicales de Balsa (Ochroma lagopus).

11. Materiales y métodos

12. Etapa I: Introducción (a) (b) • Plantas de balsa en condiciones de invernadero sometidas a tratamiento fitosanitario. • Medición de tamaño promedio para cumplir condiciones fenotípicas.

13. Etapa II: Desinfección (a) (b) (c) (d) (e) (f) Protocolo de Desinfección: (a)Yemas apicales (b)Lavado en agua corriente. (c) Lavado en agua estéril. (d) Combinación de fungicidas. (e) Alcohol. (f) Cloro.

14. Procedimiento mecánico para la eliminación de tricomas. • Yema apical de Balsa, se distingue presencia de tricomas. Etapa III: Siembra (a) (b)

15. Medio de cultivo • Las concentraciones usadas fueron: • agar 6,5 g/L • Azúcar 25 g/L • Sulfato de adenina 0,5 mg/L • L – Cisteína 30 mg/L • Ácido ascórbico 30 mg/L • Carbón activado 200 mg/L • Inositol 100 mg/L • Amistar TOP (Azoxystrobin, Difenoconazol) 50 ul/L • pH 5,7 • El medio de cultivo fue esterilizado en el autoclave durante 30 minutos a 121oC y 15 PSI.

16. Etapa de desinfección Tratamientos de desinfección utilizando hipoclorito de sodio

17. Resultados y discusión

18. Contaminación Tabla de comparación de Fisher para la contaminación con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus respectivos tiempos de inmersión.

19. Necrosis Tabla de comparación de Fisher para la necrosis con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus respectivos tiempos de inmersión.

20. Supervivencia Tabla de comparación de Fisher para la supervivencia con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio y sus respectivos tiempos de inmersión

21. Contaminación, Necrosis y Supervivencia • Explantes vivos, explantes contaminados, explantes necrosados en los tratamientos de hipoclorito de sodio: • Tratamiento 1 (0.5% - 40 min) • Tratamiento 2 (1.0% - 30 min) • Tratamiento 3 (1.5% - 20 min) • Tratamiento 4 (2.5% - 10 min).

22. Desinfección con fungicidas más hipoclorito de sodio 0,5% y 40 min de inmersión

23. Contaminación Tabla de comparación de Fisher para la contaminación con respecto a concentración de hipoclorito de sodio 0,5% - 40 min, mezclada con la concentración de fungicida y la mejor combinación de fungicida.

24. Necrosis Tabla de comparación de Fisher para la necrosis con respecto a la concentración de hipoclorito de sodio 0,5% - 40 min, mezclada con la concentración de fungicida y la mejor combinación de fungicidas.

25. Supervivencia Tabla de comparación de Fisher para la supervivencia con respecto a la concentración de fungicida y combinaciones de fungicida con el mejor tratamiento de hipoclorito de sodio (0.5% - 40 min).

26. Contaminación, Necrosis y Supervivencia Explantes vivos, necrosados y contaminados en los tratamientos de fungicida más hipoclorito de sodio 0.5% - 40 min.

27. Supervivencia Explantes vivos en los tratamientos con hipoclorito de sodio y en los tratamientos con fungicida más hipoclorito de sodio 0.5% - 40 min.

28. Yema apical de balsa con aparecimiento de callo Yema apical de balsa con aparecimiento de brote Etapa IV: Incubación

29. Tratamientos de inducción Tratamientos para inducción de brotes

30. Formación de callo y aparecimiento de brote Formación de brote vs. aparecimiento de callo en los tratamientos de inducción para yemas de Ochroma lagopus; tratamiento 1 (BAP 0.1 mg/L), tratamiento 2 (BAP 0.2 mg/L), tratamiento 3 (BAP 0.3 mg/L), tratamiento 4 (BAP 0.4 mg/L), tratamiento 5 (BAP 0.5 mg/L).

31. 1 2 4 1 2 3 Conteo número de brotes que contiene cada explante. Etapa V: Multiplicación

32. (a) Explantes en etapa de multiplicación (a) BAP, (b) TDZ Etapa V: Multiplicación (b)

33. Multiplicación Tratamientos para multiplicación utilizando BAP en combinación con ANA, nueve tratamientos más un testigo.

34. BAP vs. ANA Formación de brotes en los tratamientos de multiplicación para Ochroma lagopus, utilizando combinaciones de BAP y ANA.

35. Formación de brotes BAP vs. ANA Porcentaje de formación de brotes en los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

36. Longitud del explante BAP vs. ANA Longitud promedio de los explantes medidas en (mm), obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

37. Porcentaje de longitud del explante BAP vs. ANA Porcentaje de la longitud de los explantes, obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

38. Longitud de brotes BAP vs. ANA Análisis de varianza para la longitud de los brotes usando combinaciones de hormonas: BAP vs. ANA

39. Longitud de explantes BAP vs. ANA Longitud promedio de los explantes, obtenidas de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA.

40. Formación de brotes BAP vs. ANA Tabla de contingencia para la formación de brotes usando combinaciones de hormonas: BAP vs. ANA

41. Multiplicación Tratamientos para multiplicación utilizando TDZ en combinación con ANA, nueve tratamientos más un testigo.

42. Brotes TDZ vs.ANA Formación de brotes en los tratamientos de multiplicación para Ochroma lagopus, utilizando combinaciones de TDZ y ANA.

43. Brotes TDZ vs.ANA Porcentaje de formación de brotes en los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

44. Brotes TDZ vs. ANA Tabla de contingencia para la formación de brotes usando combinaciones de hormonas: TDZ vs. ANA

45. Longitud de Brotes TDZ vs.ANA Longitud promedio de los explantes medidos en (mm), obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

46. Longitud de Brotes TDZ vs.ANA Porcentajes de la longitud de los explantes, obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de TDZ vs. ANA.

47. Longitud de brotes TDZ vs. ANA Longitud promedio de los explantes, obtenidos de los tratamientos de multiplicación en los que se utilizó combinaciones de BAP vs. ANA .

48. Longitud de brotes TDZ vs ANA comparado con BAP vs ANA

49. Formación de brotes TDZ vs ANA con BAP vs ANA

50. Etapa VI: Enraizamiento Enraizamiento de plántulas de balsa