Espressione genica

1. Espressione genica External input Endogenous input

2. Microarray per l’analisi dell’espressione genica

3. Diagramma di flusso operativo di un esperimento microarray • definizione dell’ipotesi biologica indagata • identificazione di fattori di confondimento e schema di ibridazione • valutazione dei vincoli economici • valutazione dei limiti di gestione • estrazione dell’mRNA • marcatura dell’mRNA • ibridazione • lavaggio • asciugatura • scansione • “gridding” e quantizzazione numerica delle intensità di fluorescenza • estrazione delle intensità di “foreground” e di “background” • “quality control” dei dati grezzi • sottrazione del “background” • correzione degli errori sistematici attraverso la normalizzazione • verifica dell’effetto del pre-trattamento dei dati • applicazione di test statistici per determinare quali sono i geni differenzialmente espressi • validazione dei risultati con RTq-PCR • “pathway analysis” per l’interpretazione biologica dei risultati • annotazione dei risultati nelle banche dati • strutturazione secondo lo standard MIAME dell’informazione contenuta nell’esperimento • sottomissione delle informazioni a database per la pubblicazione dei dati Disegno dell’esperimento Preparazione dei campioni ed ibridazione Quantizzazione dei dati grezzi Pre-trattamento e normalizzazione dei dati Analisi statistica, validazione e annotazione dei risultati Sottomissione dell’esperimento a database pubblici

4. Da levare??? Categorie di esperimenti microarray Classi predefinite • Class comparison • Class prediction • Class discovery • Confrontare il livello medio di espressione fra gruppi di campioni e stabilire quali sono i geni responsabili di eventuali differenze • identificare geni differenzialmente espressi in differenti condizioni sperimentali: • - campioni da linee cellulari che contengono BRCA1 mutato vs campioni che contengono • BRCA1 non mutato • - campioni di cervello di ratti trattati con un farmaco vs campioni di cervello di ratti non trattati Classi non predefinite • Sviluppare profili di espressione genica differenziale da utilizzare come predittori dell’appartenenza di campioni a classi • generazione di signature tumorali • generazioni di profili di espressione che sono caratteristici di determinati stadi di crescita di una • cellula Classi non predefinite • Trovare un nuovo sistema di classificazione di campioni sulla base del profilo di espressione genica (cluster analysis) • identificare nuove sottoclassi di tumori

5. Il confronto fra le due classi è indiretto ed è realizzato attraverso il campione Reference (A vs R) vs (B vs R) Il confronto fra le due classi è diretto. Ciascun campione è ibridizzato due volte, con due fluorofori, su due array differenti Il confronto fra le due classi è diretto. Per ciascun gruppo (classe) metà dei campioni sono marcati con un fluorocromo e metà con l’altro Disegni sperimentali per class comparison Non-Reference-sample (Ai, Bi,…): tutti i campioni di interesse biologico Reference-sample (R): campione senza significato biologico che serve da baseline comune per la valutazione dell’espressione relativa fra i non-reference-sample • Reference Design • Loop Design • Balanced Block Design

6. Def: Efficienza ~ 1/varianza delle stime Obiettivo dell’esperimento microarray Precisione (efficienza) nella stima delle differenze fra le due classi Come disegno un esperimento efficiente? “Posso comprare solo 10 array (non ho problemi a reperire campioni).” “Ho solo 10 campioni (non ho problemi a comprare array).”

7. Reference Design # sample per classe = 5 # array totali = 10 Loop Design # sample per classe = 5 # array totali = 10 Balanced Block # sample per classe = 10 # array totali = 10 “Posso comprare solo 10 array “ …ma posso collezionare i campioni che mi servono • Efficienza: stima più precisa della media delle differenze fra le due popolazioni • ibridizzazione di più campioni possibile sui microarray a disposizione

8. RD LD BBD Balanced Block # sample per classe = 10 # sample totali = 20 “Posso comprare solo 10 array “ …ma posso collezionare i campioni che mi servono Svantaggi: - Poca tolleranza alle variazioni (variazione nell’appartenenza alle classi, perdita di un vetrino, etc)

9. “Ho solo 10 campioni “ …ma posso comprare gli array che mi servono • Efficienza: stima più precisa delle intensità dei singoli campioni • ibridizzazione di più array Reference Design # sample per classe = 5 # array totali = 10 Balanced Block # sample per classe = 5 # array totali = 5

10. “Ho solo 10 campioni “ …ma posso comprare gli array che mi servono Reference Design # sample per classe = 5 # array totali = 10 Svantaggi: - Collezione di innumerevoli informazioni “inutili” sul campione di Reference RD BBD

11. Balanced Block Design Reference Design Come si determina la numerosità n in maniera efficiente? Non conosciamo le limitazioni sul numero di array da acquistare o di campioni da collezionare • Per testare l’ipotesi nulla di assenza di espressione genica differenziale bisogna fissare: • un livello α di significatività • un livello 1-β di potenza • l’effect-size δ da detettare (fold change) • i livelli di varianza σ2 o τ2 dei dati • il disegno sperimentale

12. Fase “wet” di un esperimento microarray Estrazione mRNA Retrotrascrizione e Marcatura Ibridazione Scansione

13. Scansione del vetrino • Scanner a due laser • Lunghezze d’onda di eccitazione dei fluorocromi • 635 nm - Red • 532 nm - Green • Canali separati in acquisizione • formazione di due immagini • Codifica su 16 bit • 2^16 = 65536 livelli di colore • Occupazione di memoria • 130 MB c.a.

14. Scatterplot MAplot A =½ log (R*G) M = log (R/G) Imageplot Boxplot PCA 2D Metodi di visualizzazione dei dati

15. Metodi di sottrazione del “background” Subtract In =If – Ib Minimum In = If – Ib se I>0 In = min(If – Ib >0) se I<0 Normexp+offset (Ritchie et al, 2007) Ib~ N(μ, σ2) If ~ exp(λ)

16. Risultati Dati grezzi Subtract Minimum Normexp+ offset

17. Metodi di normalizzazione Diversa efficienza di incorporazione dei due fluorocromi; Diversa efficienza di emissione dei due fluorocromi; Diversa efficienza dello scanner nel leggere i due canali. Correzione degli errori sistematici generati dalla procedura sperimentale Sistema di rivelazione per fluorescenza

18. Metodi di normalizzazione within array Ciascun array viene normalizzato separatamente Obiettivo: centrare su ciascun array la distribuzione dei log-fold-change ed eliminare gli errori intensità-dipendenti - Trasformazione linlog per attenuare l’effetto della sottrazione del rumore alle basse intensità, i dati di intensità sono presi in scala lineare alle basse intensità e in scala logaritmica alle medie e alte intensità - Metodo globale: median o centraggio della mediana valutazione dello scostamento della mediana (o media) della distribuzione reale dei log-fold-change da quella ideale ed eliminazione - Metodo intensità-dipendente: LOESS interpolazione di polinomi di primo e secondo grado a finestre di dati per determinare la “smoothing curve”. Tale curva viene utilizzata sulla visualizzazione MA dei dati per riportare la distribuzione reale dei dati a quella reale

19. Metodi di normalizzazione between arrays Tutte le copie biologiche dello stesso gruppo vengono normalizzate insieme Obiettivo: eliminare gli errori sistematici che possono rendere eterogenei array biologicamente simili - Metodo scale riscalatura della dispersione dei log-fold-change fra array per equilibrare i valori di M fra array - Metodo di sostituzione dei quantili: quantile riscalatura dei valori delle intensità assolute fra array per uniformare le distribuzioni

20. Risultati linlog median LOESS

21. Risultati scale

22. Risultati quantile

23. Risultati

24. Esperimento ApoAI Knockout Materiali e metodi: - 16 topi C57BL/6 “black six” - in 8 topi è stato “spento” il gene che codifica per l’apolipoproteina AI - per ciascun topo è stato estratto l’RNA dal fegato, è stato isolato l’mRNA, è stato retrotrascritto in cDNA e marcato con un fluorocromo rosso Cianina Cy5 - il cDNA marcato di ciscun topo è stato mescolato con un’aliquota di un campione di riferimento, ottenuto facendo il pool degli RNA degli 8 topi di controllo e marcando il materiale così ottenuto con il fluorocromo verde Cianina Cy3 - le 16 miscele sono state ibridizzate su 16 microarray distinti

25. Esperimento Swirl zebrafish Materiali e metodi: - 2 pesci zebra - in 1 pesce è presente una mutazione sul gene BMP2 - per ciascun pesce è stato estratto l’RNA, è stato isolato l’mRNA, è stato retrotrascritto in cDNA. Il cDNA di ogni pesce è stato diviso in quattro aliquote. - Due aliquote di cDNA di pesce mutato sono state marcate con il fluorocromo rosso Cianina Cy5 e le altre due con il fluorocromo verde Cianina Cy3. Analogamente per il cDNA del pesce wild-type. - il disegno sperimentale è di tipo diretto con dye-swap