La regolazione dell’espressione genica

1. La regolazione dell’espressione genica Tutte le cellule di un organismo multicellulare possiedono tutti i geni della propria specie; tuttavia solo una piccolissima frazione è attiva in ogni cellula; per esempio, in una cellula delle isole del pancreas è attivo il gene per l’insulina, non quelli per l’emoglobina (attivi nelle cellule dei midollo osseo, progenitrici dei globuli rossi) o per la pepsina (attivi nelle cellule della mucosa gastrica) Durante lo sviluppo embrionale di un organismo multicellulare, le cellule destinate a costituire i diversi tessuti e organi attivano in momenti precisi i geni che codificano le proteine che stimolano o inibiscono la proliferazione cellulare e quelle caratteristiche del tessuto in formazione (per esempio osseina per le ossa, cheratina per la pelle) Anche gli organismi unicellulari hanno bisogno di attivare alcuni geni solo in particolari circostanze (per esempio la presenza di un nutrimento che richiede particolari enzimi) per non sprecare l’energia e le molecole necessarie Le cellule tumorali hanno perduto, anche in seguito a mutazioni somatiche, la capacità di regolare l’espressione genica relativa alle proteine che controllano la proliferazione cellulare Dunque nelle prossimità dei geni ci devono essere recettori in grado di percepire segnali provenienti dall’ambiente esterno e veicolati all’interno della cellula; tali recettori devono quindi segnalare ai geni se trascrivere o no, in funzione dei segnali provenienti dall’esterno

2. H OH HOC6’H2 C3’ C2’ C5’ O H OH O OH H H HOC6’H2 HOC6’H2 C4’ C1’ C4’ C1’ C5’ C5’ O O H H H H OH OH H H H C5’ O C3’ C2’ C4’ C4’ C1’ C1’ HOC6’H2 H OH OH OH H H C3’ C3’ C2’ C2’ H H OH OH OH OH OH H H OH H H Il sistema lac in E. coli Lattosio + H2O L’enzima b-galattosidasi, che consente di utilizzare il lattosio come fonte di carbonio e di energia, viene sintetizzato in presenza di lattosio che quindi oltre che esserne il substrato è anche l’induttore della sua sintesi b-galattosidasi Dal lattosio è indotta la sintesi di altri 2 enzimi: permeasi e transacetilasi; anche la permeasi è coinvolta nel metabolismo del lattosio, poiché facilita l’ingresso del lattosio nella cellula. Glucosio Galattosio

3. I geni strutturali e il gene I I+ = allele normale:Z, Y, A trascrivono in presenza dell’induttore; I- = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre; Is = allele inibente la risposta all’induttore: Z, Y, A non trascrivono mai I Z Y A trascrizione Merodiploidi per definire le relazioni funzionali tra gli alleli Un unico mRNA policistronico traduzione transacetilasi b-galattosidasi F’(lac) permeasi Geni lac 1) Is è dominante su I+ che a sua volta è dominante su I- *unmRNA per un enzima funzionale 2) I+ è dominante su I- indipendentemente dalla posizione in cis o in trans rispetto a Z+

4. Operatore, promotore e operone I P O Z Y A operone O+ = allele normale:Z, Y, A trascrivono in presenza dell’induttore; Oc = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre Il prodotto del gene I è una proteina diffusibile che, in assenza dell’induttore, si lega ad O e impedisce la trascrizione di Z, Y , A; in presenza dell’induttore non si lega ad O e consente la trascrizione di Z, Y, A *unmRNA per un enzima funzionale 1) Oc è dominante su O+, ma solo in cisrispetto a Z+ (cis-dominanza) 2) Gli alleli normali di P sono cis-dominanti sui mutanti difettivi di P, che impediscono incondizionatamente la trascrizione di Z, Y, A, impedendo l’inserimento della RNA polimerasi

5. induttore Controllo negativo dell’espressione genica nell’operone lac repressore non legato all’induttore, che si lega ad O e impedisce la trascrizione RNA polimerasi I P O Z Y A repressore legato all’induttore, che nonsi lega ad O e non impedisce la trascrizione mRNA I P O Z Y A I- repressore I- senza affinità per O, con cuinonsi lega mai e non impedisce mai la trascrizione repressore Is senza affinità per l’induttore, che si lega sempre ad O e impedisce sempre la trascrizione I P O Z Y A Is operatore senza affinità per il repressore che non lega mai e non impedisce mai la trascrizione I P O Z Y A Oc I P O Z Y A promotore senza affinità per l’RNA polimerasi che impedisce sempre la trascrizione P-

6. Controllo positivo dell’espressione genica nell’operone lac A basse concentrazioni di glucosio aumenta la concentrazione di AMP ciclico (cAMP). cAMP si lega a una proteina attivatrice (CAP). P O Z Y A mRNA RNA polimerasi cAMP …e, in presenza di lattosio, che “blocca” il repressore,… Il complesso CAP-cAMP si lega al promotore e ne aumenta l’affinità per l’RNA polimerasi… CAP …intensifica la trascrizione di Z, Y ed A. Controllo negativo dell’espressione genica nell’operone trp repressore non legato al triptofano, che non si lega ad O e consente la trascrizione P O trpE trpD trpC trpB trpA triptofano mRNA RNA polimerasi repressore legato al triptofano, che si lega ad O e non consente la trascrizione

7. C H3 HO C C H2 O Organizzazione della cromatina e controllo della trascrizione negli eucarioti L’acetilazione degli istoni, mediata dalle proteine attivatrici e da trans-acetilasi, allenta il legame con il DNA, che diventa accessibile ai fattori di trascrizione e alla RNA polimerasi Nei nuclei in interfase i cromosomi hanno domini separati, che si possono vedere con sonde specifiche Le regioni che devono trascrivere si spostano alla superficie dei domini attivatore transacetilasi deacetilasi La metilazione degli istoni compatta la cromatina e rende il DNA inaccessibile acetile Terminata la trascrizione, gli istoni sono deacetilati con l’azione di una deacetilasi e si ripristina il legame DNA-istoni nei nucleosomi, tornando alle condizioni di riposo. metile

8. Regolazione della trascrizione negli eucarioti: promotore e intensificatori Regioni regolatrici dei geni eucariotici Regioni Sequenze, Funzioni Posizioni Regione centrale del promotore TATA box Legame con fattori di trascrizione, RNA polimerasi II 25-30 nucleotidi a monte Promotore (altre regioni) CAAT box e/o GC box Legame con fattori di trascrizione (generali e specifici) Distanze varie, a monte Intensificatori Varie Legame con proteine attivatrici, modificazione della cromatina Varia Attivatori Complesso di fattori di trascrizione RNA polimerasi II CAAT box TATA box Intensificatore

9. H H H H C H N H C C C H N N C C O C Inattivazione a lungo termine della trascrizione negli eucarioti: eterocromatina costitutiva e facoltativa Le regioni cromosomiche con la cromatina compatta sono visibili nei nuclei in interfase come zolle più colorate e costituiscono l’eterocromatina Il compattamento avviene con l’avvolgimento dei nucleosomi a formare il solenoide… …e con il ripiegamento della cromatina sulla matrice. Le regioni con DNA satellite non hanno geni, non trascrivono mai e sono sempre compatte (eterocromatina “costitutiva”) Il cromosoma X inattivo rimane condensato in interfase (eterocromatina “facoltativa”), ove è visibile come “corpo di Barr”. La metilazione della citosina nel DNA in sequenze 5’CG3’ è connessa con l’inattivazione del cromosoma X Durante le fasi precoci dell’embriogenesi uno dei 2 cromosomi X di femmine di mammifero è inattivato a caso in ciascuna cellula somatica e l’inattivazione è ereditata dalla discendenza cellulare; i tessuti somatici femminili sono mosaici clonali “epigenetici”, cioè d’espressione genica.

10. Inattivazione a lungo termine della trascrizione negli eucarioti: l’imprinting genomico Durante la gametogenesi sono inattivati alcuni geni specifici, che sono diversi nelle cellule germinali maschili e femminili (“imprinting genomico”). Disomia uniparentale geni inattivati nei gameti maschili geni inattivati nei gametifemminili Nelle fasi precoci dello sviluppo embrionale l’inattivazione viene rimossa nella linea germinale La metilazione della citosina nel DNA in sequenze 5’CG3’ è connessa con l’imprinting genomico Zigote bilanciato geneticamente (tutti i geni in 2 copie) ed epigeneticamente (almeno una copia attiva di tutti i geni). Zigote bilanciato geneticamente (tutti i geni in 2 copie) ma sbilanciato epigeneticamente (almeno ungene non ha una copia attiva). La metilazione della citosina nel DNA in sequenze 5’CG3’ è connessa infine con l’inattivazione di geni ad azine tessuto-specifica

11. Il controllo dopo la trascrizione negli eucarioti Controllo quantitativo: l’interferenza da RNA Complesso RISC Complesso DICER siRNA 1) Un breve (70 nucleotidi) RNA a doppio filamento viene tagliato da DICER mRNA trascrizione 2) Un dei 2 filamenti complementari residui (21 nucleotidi), detto siRNA, si lega a RISC 3) siRNA-RISC si appaia a una regione complementare di uno specifico mRNA e lo frammenta 4) I frammenti dell’mRNA sono degradati miRNA mRNA 1) Un breve (70-130 nucleotidi) RNA a forcina viene tagliato da DICER 3) Un dei 2 filamenti complementari residui (19-24 nucleotidi), detto miRNA, si appaia a una regione complementare all’estremità 3’ non tradotta di uno specifico mRNA e ne blocca la traduzione

12. Il controllo della traduzione negli eucarioti b-tubulina …. …. In assenza/bassa concentrazione di b-tubulina, la traduzione dell’mRNA della b-tubulina procede fino al completamento e il rilascio del polipeptide. Glu- Glu- …..- aan Ile Ile -aa5- Met- Met- Arg- Arg- aa6- b-tubulina …. …. AUG 5’ AAAAAAAA 3’ RNasi In presenza di concentrazioni alte di b-tubulina, la traduzione dell’mRNA della b-tubulina è bloccata dal legame che si crea tra alcuni aminoacidi centrali della b-tubulina già presente nel citoplasma con i primi 4 aminoacidi della b-tubulina nascente; tale complesso induce l’azione di una Rnasi che taglia e degrada l’mRNA legato al ribosoma. AUG 5’ AAAAAAAA 3’

13. Un gene più catene polipeptidiche? “editing” dell’mRNA mRNA Cambiamenti nella sequenza degli mRNA possono avvenire per inserzione/delezione di base (p. es mRNA mitocondrali) UUUU mRNA Cambiamenti nella sequenza degli mRNA possono avvenire per isostituzione di base (p. es mRNA dell’apolipoproteina B nell’intestino umano) U C AA “splicing” alternativo Esoni “costitutivi” pre-mRNA Esoni “facoltativi” Introni mRNA alternativi Al gene SLO nell’uomo sono attribuiti 500 possibili mRNA nelle cellule della coclea Al gene Dscam in Drosophila sono attribuiti più di 30.000 possibili mRNA nei neuroni

14. Splicing alternativo: determinazione del sesso in Drosophila Sxl X X X Y Tra SXL pre-mRNA Polipetide tradotto AUG AUG AUG AUG UAG UAG UGA UGA TRA TRA- Dsx UAG UAG UGA UGA pre-mRNA Polipetide tradotto DSX f DSX m Differenziamento maschile Differenziamento femminile

15. Batterio Cellula contenente il gene da isolare Plasmide isolato DNA purificato Gene da isolare Cromosoma batterico Plasmide Inserimento del plasmide nella cellula batterica Copie delle proteine come ad esempio insulina, ormone della crescita Copie del gene isolato duplicazione Ingegneria genetica Le tecniche dell’ingegneria genetica permettono di isolare un gene che codifica per una determinata proteina e di inserirlo, mediante dei vettori adatti, nel genoma di un altro organismo. Queste tecniche sono state applicate al campo della medicina per la produzione farmaci, per la diagnosi di malattie genetiche, per la progettazione di vaccini. In agricoltura si stanno progettando piante e animali transgenici, per aumentarne la produttività e migliorarne la qualità. Ma tutto ciò pone problemi nuovi di carattere etico, economico, biologico che devono essere attentamente valutati per la tutela della vita e dell’ambiente. DNA ricombinante (plasmide) Batterio ricombinante

16. Enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi capaci di tagliare il DNA producendo rotture a doppia elica in corrispondenza di sequenze specifiche di nucleotidi (siti di restrizione); di essi si servono i batteri per distruggere i cromosomi virali • Un taglio è detto adesivo quando: • È sfalsato, o sono aggiunti nucleotidi al 3’; • I nucleotidi a singolo filamento, sfalsati o aggiunti, sono fra loro complementari Tipo di taglio endonucleasi Sito di restrizione G AATTC 5’3’ Sfalsato, adesivo EcoRI CTTAA G CC GG Tronco, non adesivo 5’3’ HaeIII GG CC Le estremità di un taglio adesivo si possono unire mediante i legami idrogeno tra le basi complementari presenti a singolo filamento sui 2 segmenti di DNA; successivamente, mediante l’azione di ligasi e, se serve, di DNA polimerasi, si saldano i filamenti polinucleotidici (vedere diapositiva 8) Formazione di code CC AA GG 5’3’ GG CC TT Si possono aggiungere al 3’ di uno dei 2 filamenti di un capo di un taglio tronco, non “adesivo”, una breve sequenza, ripetizione di un solo nucleotide e al 3’ dell’altro capo la sequenza complementare, rendendo adesivo il taglio I siti di restrizione sono brevi sequenze palindromiche: la sequenza posta a un lato rispetto al centro del sitoè complementare alla sequenza inversa rispetto a quella posta al lato opposto

17. Marcatura con con 32P Siti di restrizione dell’enzima Siti di restrizione dell’enzima Mappe di restrizione Una mappa di restrizione consiste nell’identificazione della successione dei siti di restrizione per diverse endonucleasi in un segmento di DNA, misurando la distanza tra i siti come numero di nucleotidi 1) Si esamina un frammento di DNA, marcandolo con 32P al 5’ 2) Si digerisce il frammento con diversi enzimi di restrizione 3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorso su un gel mediante elettroforesi L’elettroforesi consiste nel collocare le macromolecole in un pozzetto all’estremità di un gel (gelatina) che viene poi sottoposto un campo elettrico; le molecole si spostano con una velocità proporzionale alla propria carica elettrica e inversamente proporzionale lla propria lunghezza; poiché nel DNA la carica è distribuita uniformemente, la velocità dipende solo dalla lunghezza del frammento

18. Il DNA ricombinante DNA da clonare vettore VETTORI Sono cromosomi capaci di replicare e selezionabili, in cui si possono inserire segmenti di DNA di interesse Digestione con endonucleasi DNA polimerasi I + ligasi I vettori possono essere : -plasmidi, -cromosomi di fagil, -ibridi fago-plasmide (cosmidi), tutti capaci di replicarsi in E. coli, -YAC, cioè cromosomi artificiali di lievito, capaci di replicarsi in lievito In ogni tipo di vettore si può inserire un frammento di DNA di una particolare lunghezza massima Estremità adesive spontanee o costruite, fra loro uguali Estremità adesive complementari alle precedenti

19. La clonazione del DNA Individuazione dei geni clonati: Southern blotting Clonazione non selettiva P = 1-(1-f)N Clonazione selettiva Genoma da saggiare frammentato con enzimi di restrizione L’ibridazione cn la sonda radioattiva si effettua direttamente sui frammenti del genoma, identificando così il frammento da saggiare Cromosomi di l frammentati 1) Si effettua l’elettroforesi su gel dei frammenti a doppia elica ligasi Genoteca di DNA ricombinante 2) Si denatura il DNA e lo si fa aderire a singolo filamento, nelle stesse posizioni, a un filtro Clonazione 3) Si ibridizza con sonda radioattiva complementare al frammento cercato e si effettua l’autoradiografia, localizzando così il gene studiato Ibridazione su filtro con sonda radioattiva complementare al DNA da studiare

20. C-DNA, walking cromosomico e sequenziamento cDNA WALKING CROMOSOMICO RNA Mediante piccole sonde, in comune a più frammenti è possibile mettere questi ultimi in sequenza AAAAA TTT Trascrittasi inversa DNA polimerasi primer IL cDNA CONSENTE DI STUDIARE GLI mRNA E CONFRONTARLI CON I GENI O I TRASCRITTI PRIMARI SEQUENZIAMENTO DEI NUCLEOTIDI 1) Si marca con 32P l’estremità 5’ del frammento da analizzare, quindi si denatura il DNA G G+A C C+T 2) Si distruggono selettivamente basi o loro combinazioni (G, G+A, C, C+T), che rendono più fragile il filamento saggiato, che quindi si rompe in quei punti G C 3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorsoin una corsa elettroforetica A T

21. Reazione a catena della polimerasi (PCR) PCR Taq polimerasi, resistente al caldo Primer 1 Regione complementare a Primer 2 Regione complementare a Si alternano cicli di denaturazione (a temperatura alta) e di replicazione ( a temperatura bassa), ciascuno dei quali porta un raddoppiamento del numero delle molecole

22. Costruire nuovi geni SINTESI DI SEQUENZE NON SU STAMPO: è possibile allungare filamenti di DNA al 5’ aggiungendo nucleotide dopo nucleotide costruendo oligonucleotidi di sequenza voluta INDUZIONE DI MUTAZIONI SPECIFICHE 3) Si modificano specifici nucleotidi sul filamento rimasto; dopo la replicazione, anche il nuovo filamento sarà mutato nello stesso sito 1) Si rompe il DNA con endonucleasi 2) Si digeriscono singoli filamenti in direzione 5’ con esonucleasi

23. TCCAAT TCCAA TCCA TCC TC T Progressi nel sequenziamento Sequenziamento del DNA di singoli cromosomi 2) Colorazione con 2 fluorocromi, rispettivamente specifici per A-T e G-C, la cui emissione risultante è specifica per ciascun cromosoma 1) Raccolta di cromosomi in metafase con shock osmotico Isolamento di singoli cromosomi con citometria a flusso 3) Singoli cromosomi contenuti in microgocce sono riconosciuti da sensori laser… 4) Si effettua l’elettroforesi dei nuovi filamenti… Sequenziamento automatico del DNA 1) Si dispone di singoli filamenti di DNA con primer e DNA polimerasi 3’ primer G AGGTTAC T A 2) Si forniscono miscele di nucleotidi contenenti di-desossi-nucleotidi, privi di –OH al C3’, che bloccano l’allungamento del nuovo filamento di DNA A C C T ddA ddG ddC ddT 5’ 4) …ricevono una carica elettrica specifica… TCCAATG 5’ 3’ 3) Ciascun di-desossinucleotide è marcato con un fluorocromo specifico 5) …e sono deviati da un campo elettrico nella “propria” provetta 5) …e mediante spettroscopia automatica, si ottiene il profilo della sequenza

24. Dalla mappatura al sequenziamento del genoma Sequenziamento “clone dopo clone” Marcatori molecolari Alleli dei siti di restrizione (RFLP) 1) Mappatura di restrizione (“fingerprinting”) di una raccolta di grandi cloni da una genoteca, identificando le sovrapposizioni Sito di restrizione Trattamento con l’enzima di restrizione Allele non “tagliabile” Alleli per singole sostituzioni nucleotidiche (SNP) 2) Selezione del numero minimo di cloni sovrapposti 3) Frammentazione in sub-cloni dei grandi cloni superstiti e loro sequenziamento Alleli per numero di ripetizioni di mini- e microsatelliti (SSLP) Identificati per sequenziamento Sequenziamento “shotgun” 1) Frammentazione di genomi in genoteche di cloni di diversa grandezza Mappature di marcatori molecolari fra loro/con geni Mappe genetiche (ricombinazione) 2) Sequenziamento di successivi campioni casuali di cloni di diversa grandezza e analisi automatizzata delle sequenze sovrapposte (“prova ed errore”) Mappe cromosomiche: ibridazione in situ con sonde fluorescenti (FISH) Mappe fisiche: sequenziamento del genoma

25. Genomica strutturale Il sequenziamento del genoma utilizza le metodiche già descritte seguendo diverse fasi 1: compilazione – consiste nella ripetizione per numerose volte dell’intero processo per riempire le lacune e correggere gli errori dovuti alla natura empirica e casuale del processo Le lacune, oltre agli errori di metodo, sono dovute a regioni difficilmente sequenziabili: DNA satellite e geni ripetuti in tandem 2: annotazione – consiste nell’identificazione di presunti geni, riconoscibili come “open reading frames” (ORF), nel caso di codificazione di polipeptidi Le ORF iniziano con codoni di inizio traduzione (sul filamento trascritto 3’TAC5’, su quello complementare 5’ATG3’) e , dopo numerose triplette, terminano con codoni di stop. In un tratto di DNA sequenziato per la ricerca di ORF sono possibilli 3 tentativi di lettura, sfalsati di un nucleotide, per ciascuno dei due filamenti complementari. 3: verifica delle ORF – consiste nella ricerca in prossimità delle ORF di altre sequenze funzionali (promotori; negli eucarioti siti di splicing, di poliadenilazione etc.). Solo il 5% del genoma umano consiste nei suoi circa 26.000 geni; il 10% consiste in DNA satellite, il 50% in elementi trasponibili interspersi. Oggi sono disponibili software sofisticati che minimizzano gli errori, tenendo conto di caratteristiche note del genoma (p. es. abbondanza di “isole CpG”- 5’CG3’ in prossimità di geni)

26. Genomica funzionale e proteomica Genomica funzionale Data l’estrema maggiore ricchezza del repertorio proteico (proteoma) di un organismo rispetto al genoma, è utile indagare il proteoma nel suo complesso. 1) Una volta identificata una ORF come possibile gene, per verificare la funzione del polipeptide codificato si ricorre a banche dati di sequenze geniche note. Si effettua un’elettroforesi bidimensionale del proteoma espresso in determinate condizioni ambientali di una popolazione cellulare. 2) Si effettua un confronto dettagliato con i geni simili trovati. Si possono ottenere 102 -104 diverse macchie. 3) Si analizzano i ”motivi” funzionali dei polipeptidi codificati, con l’ausilio di banche dati di catene polipeptidiche. Una volta isolata una proteina nel proteoma, prelevandola dal gel, la si tenta di identificare con una digestione parziale e il confronto con banche dati di catene polipeptidiche e loro frammenti. Ancora oggi per moltissime ORF dei genomi finora sequenziati non è stata definita una funzione. Microarray a DNA Gli oligonucleotidi di ciascuna riga riguardano lo stesso gene, con l’allele normale e diverse mutazioni. Su una lastra sono collocati 104 -105pozzetti, ciascuno con un oligonucleotide a singolo filamento di DNA. Il/i gene/i da saggiare è amplificato per PCR, coniugato con fluorocromi e collocati sul microarray. Solo sequenze complementari si legheranno ai pozzetti, rivelando eventuali mutazioni.

27. Genetica diretta e genetica inversa Genetica diretta Genetica inversa 1) Si inducono mutazioni casuali (con radiazioni, sostanze chimiche, elementi trasponibili). 1) Si isola e si sequenzia una proteina la cui funzione deve essere indagata). 2) Si effettua uno screening genetico, attrverso test specifici, per riconoscere i mutanti. 2) Si determinano le possibili sequenze di cDNA, costruendo un corredo di oligonucleotidi. 3) Si assegnano i nuovi mutanti ai propri gruppi di complementazione, identificando il gene mutato. 3) Si saggiano gli oligonucleotidi con i cloni di una ganoteca, identificando il gene putativo. 4) Si analizza il ruolo dell’eventuale nuovo gene nella rete di interazioni fra geni (epistasi, soppressione etc.). 4) Si confronta la sequenza polipeptidica codificata dal gene putativo con sequenze presenti in banche dati, cercandone i motivi funzionali. 5) Si mappa il gene, prima costruendo una mappa genetica, quindi una mappa fisica. 5) Si costriscono mutanti “knock out” (con perdita di funzione, spesso delezioni intrageniche) o con sostituzione genica, mediante mutagenesi sito-specifica e se ne studiano gli effetti fenotipici. 6) Si clona e si sequenzia il gene. 6) Si possono usare gli siRNA per inattivare i geni bersaglio, al posto dei mutanti knock out (silenziamento epigenetico