Sklop H

1. Sklop H • Forenzična genetika - prstni odtis DNA • ___ • DNA-diagnostika • Uporaba metod rDNA v arheologiji, sistematiki in ekologiji • Proizvodnja rekombinatnih reagentov

2. Prstni odtis DNA Analiza variabilnih zaporedij v človekovem genomu nam pomaga v kriminalistiki in sodstvu na več področjih: - identificiranje posiljevalcev (~2/3 primerov) in drugih zločincev - določanje očetovstva - ugotavljanje sorodstva pri imigrantih, ki so že dobili državljanstvo - identifikacija žrtev Leta 1980 so opisali prvi polimorfni marker za RFLP. FBI je prvi primer reševala na osnovi lastnosti DNA leta 1988. V postopku je treba analizirati in primerjati vzorec s kraja zločina, vzorec žrtvine DNA in DNA osumljenca (ali več osumljencev). Problemi: v vzorcih je prisotnih več DNA / DNA je pogosto razgrajena / pogosto so prisotni inhibitorji PCR Vrste vzorcev: kri, sperma, slina, urin, lasje/dlake, zobje, kosti, mehka tkiva

3. Primerjava identifikacijskih postopkov na osnovi DNA: • RFLP (polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov) • VNTR (spremenljivo število tandemskih ponovitev) • STR (kratke tandemske ponovitve)

4. RFLP (polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov) • VNTR (spremenljivo število tandemskih ponovitev) • STR (kratke tandemske ponovitve)

8. Molekularna diagnostika Predpogoj za uspešno zdravljenje je pravočasno detektiranje povzročiteljev - velja za ljudi, živali, rastline in okolje. Klasični postopki detekcije so vključevali odvzem okuženega vzorca, rast povzročiteljev bolezni v kulturi in analize fizioloških lastnosti, ki so privedle do identifikacije. Taki postopki pa so zamudni in dragi. Nekateri povzročitelji bolezni so tudi zahtevni za gojenje (npr. Chlamydia trachomatis, obvezni intracelularni parazit). Molekularna diagnostika za identifikacijo ne potrebuje izoliranih patogenov in je zato bolj zanesljiva in hitrejša. Uporabljamo imunološke metode ali analiziramo DNA. Diagnostične metode morajo biti: - specifične (pozitivni rezultat smemo dobiti samo s tarčnim organizmom ali molekulo, ne pa z vsemi ostalimi) - občutljive (zaznati moramo čim manjše količine povzročitelja, tudi v prisotnosti nečistoč) - enostavne (za rutinsko uporabo) Novejše metode omogočajo detekcijo signala tudi pri DNA iz onesnaženih vzorcev.

9. Predanalizna stopnja: - odvzem vzorca - stabilizacija DNA - liziranje vzorca - izolacija DNA Analizna stopnja: - modificiranje / pomnoževanje DNA - detekcija DNA - analiza podatkov

11. Vrste testiranj (splošno) • presejalno (možnost, da pride do razvoja bolezni); npr. AFP • diagnostično (zaznavanje obstoječe bolezni); npr. amniocenteza, CVS

12. Predimplantancijska genetska diagnostika (PGD) • pri oploditvah in vitro • testirajo prisotnost anevploidije (trisomij ali izpadov kromosomov), translokacij in okvar posameznih genov ter status HLA • vzorec za analizo so embrionalne celice po biopsiji ali polarno telesce (ko analizirajo samo materino polovico genskega nabora) • http://reproductivegenetics.com/pgd.html

14. DNA-diagnostika Genetski material vsebuje vse bistvene informacije, ki opredeljujejo povzročitelja bolezni (npr. virulenčni geni) ali mutacije, ki povzročijo nastanek bolezni pri človeku (npr. cistična fibroza). Osnova za izvedbo testov je dolgo bila hibridizacija (glej sklop D2), v zadnjem času pa PCR. Postopek s hibridizacijo ima naslednje ključne stopnje:- vezava tarčne ssDNA na membrano- vezava sonde (ssDNA) pod pogoji, ki omogočajo hibridizacijo s tarčo- spiranje membrane- detektiranje hibridnih zaporedij Specifičnost zagotavlja sestava sonde - ta se sme vezati samo na zaporedje, ki ga želimo detektirati. Sonde so lahko DNA ali RNA, kratke (<50 b) ali dolge (>100 b), sintetizirane ali klonirani geni ali fragmenti naravne DNA. Razlikujejo lahko med vrstami ali sevi povzročitelja ali med posameznimi geni.

15. DNA-diagnostika /2 Zaporedje, ki bi ga lahko uporabili kot sondo, lahko poiščemo tako, da pripravimo genomsko plazmidno knjižnico patogenega seva, nato pa hibridiziramo na membrani z razrezano genomsko DNA nepatogenega in patogenega seva. Signal, ki ga dobimo samo z DNA iz patogenega organizma, lahko služi kot sonda. Testirati je treba še, če ne reagira z DNA v okolju, v katerem pričakujemo patogeni organizem (npr. človeške celice). Detekcija signala: - radioaktivno označene sonde (P-32)- neradioaktivno označevanje npr. z biotinom označene sonde  vezava avidina ali streptavidina  vezava z biotinom označenega reporterskega encima (alkalna fosfataza, peroksidaza)  reakcija s kromogenim ali kemoluminiscentnim substratom

17. DNA-diagnostika: malarija Diagnosticiranje malarije Malarijo povzroča parazit Plasmodium falciparum, ki inficira in razgradi eritrocite. Klasična analiza je mikroskopska (zamudno), obstajajo pa tudi imunološke metode (zaznajo Ab in tako detektirajo tudi prebolele bolezni). P. falciparum ima v genomu značilne ponovitve zaporedij. Pripravili so genomsko knjižnico in jo hibiridizirali z označeno razrezano genomsko DNA. Izbrali so klone, ki so dali najmočnejše signale in jih testirali z DNA iz nepatogenih vrst rodu Plasmodium. Izbrana sonda detektira >10 pg čiste DNA P. falciparum (1 ng v krvi). Podobno so pripravili sonde za detekcijo mnogih bakterijskih povzročiteljev bolezni (Legionella pneumophila, Salmonella typhi, patogeni sevi E. coli).

18. DNA-diagnostika: Chagasova bolezen Detekcija parazita Trypanosoma cruzi Protozoj se naseli v jetrih, vranici, možganih in uničuje gostiteljske celice. Pripravili so več testov, ki vključujejo PCR. Ena od teh metod vključuje pomnoževanje 188 bp dolgega fragmenta, ki se v genomu pojavlja v več kopijah, in njegovo detekcijo na PAGE. Podobni testi detektirajo tudi druge parazite, bakterije in viruse.

19. DNA-diagnostika: dedne bolezni DNA-diagnostika nam omogoča, da prepoznamo nosilce dednih bolezni in ocenimo nevarnost, da obolijo sami ali njihovi potomci. Diagnosticiranje anemije srpastih celic ASC je dedna bolezen, ki jo povzroča točkovna mutacija v zapisu za b-verigo (hemo)globina (Glu6Val). Molekula Hb je pri homozigotih strukturno spremenjena; protein ne more vezati dovolj kisika, kar privede do anemije in poškodb srca in drugih organov. Heterozigoti ne zbolijo, so pa prenašalci gena. Bolezen je pogostejša med temnopoltimi Afričani in Latinoameričani, zato v ZDA rutinsko testirajo prebivalstvo. Z mutacijo se eliminira restrikcijsko mesto za CvnI: CC/TNAGG CCTGTGG Če pomnožimo regijo, ki morda vsebuje mutacijo,in produkt cepimo s CvnI, lahko po AGE in barvanju z etidijevim bromidom detektiramo razliko med normalnim in mutiranim zapisom - hibridizacija ni potrebna. Lahko pa s CvnI razrezan gen za b-globin hibridiziramo s sondo, ki predstavlja fragment med prvima dvema mestoma CvnI v normalnem genu. Iz razporeditve in velikosti označenih fragmentov lahko določimo genotip preiskovancev. Zaradi točkovne mutacije je prišlo do razlik v sliki restrikcijskih fragmentov (RFLP): SNP (single nucleotide polymorphism).

20. DNA-diagnostika: PCR/OLA V primeru, ko mutacija ne povzroči spremembe v sliki restrikcijskih fragmentov, moramo izvesti detekcijo na drugačen način. PCR/OLA: PCR v kombinaciji s preskusom ligiranja oligonukleotidov Sintetiziramo 2 oligonukleotida, ki se hibridizirata na normalnem zapisu levo in desno od mesta, kjer je možna (z boleznijo povezana) mutacija. Oba oligonukleotida sta na koncu označena, en z biotinom, drugi z digoksigeninom. Tarčno DNA pomnožimo in hibridiziramo z označenima oligonukleotidoma ter dodamo ligazo. Če je bila mutacija prisotna, se označena oligonukleotida ne bosta mogla povezati, če pa mutacije ni, pa se povežeta. [Pripravimo lahko tudi obrnjen poskus - da se oligonukleotida hibridizirata na mutirano zaporedje, ne pa na naravno.] Po hibridizaciji DNA denaturiramo, da se (ne)ligirana kratka DNA sprosti, in DNA preko biotina vežemo na imobiliziran streptavidin. Dodamo še protitelesa proti digoksigeninu, ki so konjugirana z alkalno fosfatazo ter substrat in detektiramo obarvani produkt. Obstajajo avtomatizirani postopki za analizo po opisanem postopku, ki imajo kapaciteto do 1200 vzorcev dnevno.

21. DNA-diagnostika: fluorescenčne oznake Mutacije, ki se pojavljajo na enem mestu, lahko detektiramo s PCR v postopku s tremi oligonukleotidi. Dva se prekrivata z regijo, kjer je možna mutacija: eden, ki ga označimo z rodaminom, ima zaporedje, ki je komplementarno naravnemu, drugi, ki je komplementaren mutiranemu zaporedju, pa je označen s fluoresceinom. Tretji oligonukleotid se veže na oddaljeno regijo in ni označen. V reakciji se bo odvisno od tarčnega zaporedja v vzorcu DNA pomnoževal zapis z enim ali drugim od markiranih oligonukleotidov ali pa z obema, če gre za heterozigotno zaporedje. ZDA (2000): >250 molekularno-diagnostičnih laboratorijev testira za >500 genskih napak

22. Diagnosticiranjeveč mutacij Če moramo detektirati znotraj enega gena več mutacij, ki lahko povzročijo bolezen, postopek vključuje PCR in hibridizacijo. Primer: talasemija b: 8 možnih mutacij v genu za globin b; heterozigoti imajo rahle znake bolezni, homozigoti z mutacijo na kateremkoli od 8 mest, pa morajo dobivati zdravila in transfuzije. Sintetizirati je treba oligonukleotide (po 20 b), ki se popolnoma ujemajo z zaporedjem na mestu mutacije, na 3’-konec pa dodamo homopolimerni rep iz ~400 T. Preko tega repa sondo vežemo na točno določeno mesto na najlonski membrani. DNA, ki jo testiramo, pomnožimo v 1 reakciji s pari oligonukleotidov, ki pomnožujejo posamezne regije z mutacijami. Po eden iz para teh oligonukleotidov je označen na 5’-koncu z biotinom. Produkte PCR hibridiziramo z oligonukleotidi na membrani ob pogojih, ki dovoljujejo samo popolno ujemanje. Dodamo streptavidin, konjugiran z alkalno fosfatazo, membrano speremo in dodamo substrat; na mestu vezave produkta PCR (fragmenta z možno mutacijo) na pritrjen mutantni oligonukleotid se pojavi lisa.

23. UporabaDNA-tehnologije v sistematiki Molekularna taksonomija sistematizira organizme na podlagi aminokislinskih ali nukleotidnih zaporedij. Pogosto za primerjavo jemljejo zaporedja rRNA. Znanih je več kot 10.000 zaporedij, ki imajo regije z malo razlikami in bolj variabilne regije, kar olajša poravnavo. Razen tega predvidevajo, da je bil horizontalni prenos genov za rRNA zelo redek. rRNA izolirajo iz celic, jo prevedejo v DNA in regije, ki jih preučujejo, pomnožijo s PCR ter določijo nukleotidno zaporedje. Z metodami rekomb. DNA v sistematiki lahko odkrivamo majhne razlike v genomih osebkov, za katere smo v dvomih, ali pripadajo isti ali sorodni vrsti (podvrsti, sevu). Uporabljamo tako PCR-RFLP kot RAPD. Te metode so predvsem uporabne pri mikroorganizmih, kjer je fiziologija slabo raziskana, morfološke razlike pa težko določljive. Rezultat primerjave zaporedij so pogosto filogenetska drevesa (različnih oblik – odvisno od programov, ki jih uporabljajo), ki ponazarjajo stopnjo podobnosti posameznih vrst ali višjih taksonomskih kategorij med seboj.

24. Analiza črevesne flore z DNA-tehnologijo

25. UporabaDNA-tehnologije v arheologiji Vzorci stare DNA so pogosto razgrajeni do take mere, da analize sploh niso mogoče. Razen tega prihaja do kemičnih sprememb nukleotidov, ki preprečujejo natančno analizo in zmanjšujejo natančnost encimskih reakcij. Najbolj stabilna je mitohondrijska DNA. Poskušali so pomnožiti kratke fragmente DNA iz vzorca kosti kennewiškega človeka (konzerviran v blatu ~9000 let), analizirali pa so tudi DNA iz želodca Ötzija (~5000 let) in s tem ugotovili, s čim se je prehranjeval (srne, divje koze, različne zelnate rastline). http://www.cr.nps.gov/aad/kennewick/kaestle.htm

26. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 October 1; 99(20): 12594–12599.

27. analiza genoma jamskega medveda Ursus spaeleus • starost kosti ~40.000 let (čas neandertalcev) • genomska zaporedja so bila v 6 % podobna pasjim, ostalo so bila verjetno mikrobna • predpostavljajo, da so dobili 27 000 nt medvedove DNA, ki je bila 98% identična DNA današnjih medvedov • pristop omogoča analizo genoma nendaertalca

30. DNA-tehnologija v arheologiji

33. Markerji RAPD RAPD = naključno pomnožena polimorfna DNA Vzorec fragmentov DNA je uporaben tudi v identifikaciji sort in kultivarjev v agronomiji. ‘Fragmente’ DNA dobimo s PCR. Kot oligonukleotid uporabimo 9-10-mere s 50-80% (G+C) brez palindromnih zaporedij. Taki oligonukleotidi se bodo naključno vezali na kromosomsko DNA in (zaradi tako izbranih reakcijskih pogojev) pomnoževali fragmente dolžine 100-3000 bp. Vedno v reakciji uporabimo samo 1 oligonukleotid. Ker ne moremo vnaprej predvideti, kam se bo oligonukleotid vezal (morda pa se sploh ne bo), so rezultati nepredvidljivi, vendar z uporabo istega oligonukleotida in DNA iste rastline dobimo enak vzorec fragmentov. Za zelo podobne sorte rastlin bo treba verjetno izvesti več PCR z različnimi oligonukleotidi, preden bomo uspeli detektirati razliko v sliki generiranih fragmentov. Prednosti metode: iste oligonukleotide lahko uporabimo za različne rastlinske vrste; ni potrebno prenašanje na membrane, hibridizacija, označevanje; ni potrebno predznanje o zaporedjih, na katera se naj veže začetni oligonukleotid.

34. Bakterijski biosenzorji v ekologiji • Za kvantifikacijo prisotnosti polutanta so razvili rekombinantne bakterije z vključenimi geni za bioluminiscenco. • Ker naravno bioluminiscentne bakterije Vibrio fischeri živijo v morju in v ozkem pH-območju, so gene za bioluminiscenčne encime (luxCDABE) prenesli v genom Pseudomonas fluorescens. • Izrazili so se le v primeru, da so ob naključnem vnosu v genom prišli v bližino konstitutivnega promotorja in pri tem niso kritično spremenili izražanja pomembnih bakterijskih genov.

35. Rekombinanti reagenti Komercialno dostopnih je nad 300 različnih restriktaz, iz mikroorganizmov z zelo različnimi fiziologijami in značilnostmi rasti. Veliko genov za restriktaze so zato klonirali in jih izrazili v večjem obsegu v E. coli. Pri tem pa je treba preprečiti, da bi tuja restriktaza razgradila gostiteljsko DNA. Običajno to dosežejo s koekspresijo gena za metilacijo DNA. Primer: PstI (Providencia stuartii) v E. coli. Pripravili so ekspresijsko genomsko knjižnico P. stuartii v E. coli. Transformante so rasle v tekočem gojišču, nato pa so jih inficirali z bakteriofagom l. Celice, ki so izražale funkcionalni zapis za restriktazo, so preživele, ostale pa je fag liziral. Rezistentne bakterije so namnožili, jih lizirali in preverili specifičnost ter metilazno aktivnost. Proizvodnja v E. coli je bila ~10x večja kot v P. stuartii.

36. Rekombinantni reagenti /2 S tehnikami rDNA lahko spremenimo naravne metabolične poti. Vnesemo lahko nove gene ali spremenimo obstoječe, s tem pa dosežemo pretvorbo substratov v tržno zanimive spojine. Primeri: L-askorbinska kislina (reduktaza 2,5-diketo-glukonske kisline), indigo (naftalen-dioksigenaza) – poraba 13 000 t/leto (200 mio USD), sinteza aminokislin (0,8 Mt; 5 mrd USD; 50% L-Glu). Doslej so izolirali že >6000 antibiotikov iz različnih mikroorganizmov (največ tržnih antibiotikov iz Streptomyces sp.). Letna proizvodnja: 0,1 Mt, 5 mrd USD. Vsako leto ~200 novih antibiotikov (drago iskanje); na tržišču le ~2-4 novi/leto. Pri sintezi posameznega antibiotika sodeluje 10-30 različnih encimov. Zapise je treba najprej identificirati s pomočjo mutant, ki niso rezistentne, transformiramo pa jih (preko protoplastov) s plazmidi, ki imajo vključene naključne dolge odseke DNA wt seva. Nekateri plazmidi bodo komplementirali okvaro, zato vemo, da nosijo zapis za iskane biosintezne encime. S kombinacijo zapisov za posamezne encime iz različnih sevov lahko dosežemo spremembe biosinteznih poti in tvorbo novih spojin. Molekularna biotehnologija skuša tudi izboljšati proizvodnjo že znanih antibiotikov. Tako je npr. pri pripravi antibiotikov s Streptomyces spp. nivo proizvodnje odvisen od preskrbe s kisikom. Pri kulturah z visoko gostoto je ta lahko bistveni omejujoči faktor, zato so pripravili rekombinantne seve, ki so izražali hemogolobinu-podoben protein iz aerobne bakterije Vitreoscella sp. V pogojih slabe preskrbe s kisikom so rekombinantne bakterije proizvajale 10x več antibiotika aktinorodina kot nemodificirane bakterije, dosegale pa so tudi večje gostote kultur. Pristope rDNA izkoriščajo tudi pri proizvodnji biopolimerov, npr. ksantanski gumij (Xanthomonas campestris genetsko spremenjen, da raste na odpadni sirotki), melaninski derivati v E. coli, mikrobna guma (lateks-polimeraza iz kavčukovca Hevea brasilensis),…