SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM

1. SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM

2. PENGANTAR • Spektroskopiadalahilmu yang mempelajarisegalasesuatutentanginteraksiantaramateridenganradiasielektromagnetik. • Metodepengukuran yang didasarkanpadapengetahuantentangspektroskopidisebutspektrometri. • Berdasarkanpadaperbedaankeadaanmateri, dibedakan: • Spektroskopimolekuler(molecular spectroscopy) • Spektroskopi atom (atomic spectroscopy)

3. KlasifikasiSpektroskopi Atom • Berdasarkanpadasifatradiasinya, spektroskopi atom dapatdiklasifikasikankedalam • spektroskopiabsorpsiatom, • spektroskopiemisi atom ataunyala atom, dan • spektroskopifluoresensi atom.

4. SpektroskopiSerapan Atom. • Metode ini sangat populer dan bermanfaat untuk menganalisis kandungan unsur-unsur logam. • Pada prinsipnya, senyawa yang mengandung unsur logam (garam, oksida logam) dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, diatomkan (atomized) pada suhu tinggi, biasanya dengan nyala, kemudian diradiasi/disinari dengan sumber radiasi pada panjang gelombang tertentu, intensitas absorpsi (berupa garis) diteruskan ke detektor lewat monokromator, akhirnya signal dapat dibaca pada rekorder (read out). • Kadar unsur logam dihitung berdasar hubungan antara intensitas garis spektra vs kadar. Pada absorpsi ini mengakibatkan elektron terluar tereksitasi yang berlangsung pd λ tertentu bergantung jenis atomnya.

6. Padametodeinisuatusumberradiasi yang sesuai (biasanya lampukatodacekung = Hollow Cathode Lamp, HCL) dilewatkankedalamnyalaapi yang berisisampel yang telahteratomisasi, kemudianradiasitersebutditeruskankedetektormelaluimonokromator. • Untukmembedakanantararadiasi yang berasaldarisumberradiasidanradiasidarinyala, digunakanchopper yang dipasangsebelumradiasidarisumberradiasimencapainyalaapi.

7. Detektorakanmenolak(tak merespon) signal arussearah (DC) dariemisinyaladanhanyamengukurarusbolakbalik (signal absorpsi) darisumberradiasidansampel. • Konsentrasiunsurdiukurberdasarkanperbedaanintensitasradiasipadawaktuadaatautidaknyaunsur yang diukur (sampel) didalamnyalaapi.

8. Spektra atom merupakan garis-garis yang sempit (10-3 nm) pada λ yang spesifik untuk setiap unsur. Mengapa spektra atom berupa garis-garis sempit? • Sempitnya spektra absorpsi disebabkan hanya oleh eksitasi elektronik, berbeda dengan spektra absorpsi molekul (oleh eksitasi rotasional, vibrasional, dan elektronik).

9. Elemeno , nm • Ca 422.7 0.0032 • Ag 328.1 0.0016 • Mn 403.1 0.0026 • Cs 455.5 0.0030

10. Dalam praktek ada beberapa penyebab pelebaran spektra, tetapi yang sangat penting adalah pelebaran Doppler (Doppler broadening) dan pelebaran tekanan (Pressure broadening). Pelebaran Doppler disebabkan oleh gerakan atom yang menuju sumber radiasi menyerap radiasi frekuensi lebih tinggi sementara atom yang bergerak menjauhi sumber radiasi menyerap frekuensi lebih rendah. Di samping itu ada efek medan magnit dan medan listrik, serta efek tak pasti (uncertain effect) dikarenakan life time keadaan transisi (10-4 A0). • Intensitas absorpsi bergantung pada populasi atom pada keadaan dasar sementara pada spektrometri emisi bergantung pada pada populasi keadaan eksitasi, yang besarnya dihitung berdasarkan Hukum Distribusi Boltzman

11. HukumDistribusiBoltzman: • Ni = banyaknya atom dalamkeadaantereksitasi • No = banyaknya atom dalamkeadaandasar • Ei= energikeadaan tereksitasi (excited state) • Eo= energikeadaan dasar (ground state) • gi & go = faktorstatistik yang ditentukanolehbanyaknyatingkatenergi yang mempunyaienergisamapadasetiaptingkatenergi

12. Mengapa harus dilakukan atomisasi? Tujuanatomizer (atomisasi) adalahuntukmembuatrasio Ni/No sebesarmungkin, agar dimungkinkanterjadinya atom padaexcited state sebesarmungkin. • Suhuyang diperlukanuntukatomisasidapatdihitungdenganpersamaanBoltzmandiatas.

13. Contoh perhitungan populasi atom tereksitasi pd susu yg berbeda • 2000 K • Untuk Ca atom: Pj/Po = 3 • Ej = 2.93 evutkgaris spektra 422.7 D • (a) 2000 K • Nj (2.93 ev)(1 erg/6.24 X 1011 ev) • --- = 3 exp - -------------------------------------- • No (1.38 X 10-16 erg/K)(2000 K) • Ni/No = 1.23 X 10-7 = 0,00001% Hampir seluruhnya gorund state

14. (b) 3000 K • (2.93 ev)(1 erg/6.24 X 1011ev) • Ni/No= 3 exp - ---------------------------------- • (1.38 X 10-16 erg/K)(3000 K) • = 3.56 X 10-5 • % kenaikan atom tereksitasi = • (3.56X10-5 – 1.23X10-7)/1.23X10-7 = 288 kali • Jadi agar atom di keadaan dasar besar mesti digunakan suhu tdk terlalu tinggi • Populasi atom Na untuk • Transisi 3s  3p • Nexcited / Nground = 1X 10-5 = 0.001% • Ini berarti 0.001% atom Na tereksitasi secara termal • Jadi, 99.999% atom Na berada pada ground state----> baik utk penetapan dg metode absorpsi • Emisi atom menggunakan atom terksitasi • Absorpsi Atom menggunakan atom Ground state

15. Catatan • Jumlah atom tereksitasi sangat bergantung pada suhu. Oleh karena itu, suhu harus dikendalikan dengan baik. • Jumlah atom pada ground state(keadaan dasar) tidak sensitif thd suhu tetapi terpengaruh oleh kimia nyala yg bergantung pada suhu dan jenis nyala. • Kebanyakan atom berada pada keadaanground state (resonance state) dan ini yang memberikan garis absorpsi yang sempit dan disebut garis resonans (resonance line). Garis resonans ini paling intens (pling sensitif) ----> dipilih untuk penetapan kadar AAS. • Fraksi atom tereksitasi sangatbergantungterhadap sifat elemen dan suhu. • Mana lebih sensitif di antara 2 metode analisis(AA or AE) ? mengapa?

16. Pilihan garis resonans • Garis resonans adalah yang paling baik. • Garis resonans selalu lebih intens sehingga lebih sensitif untuk analisis. • Garis resonans selalu digunakan untuk konsentrasi kecil. • Kebanyakan elemen memrlukan 6-9 ev (electron volt)utk berlangsungnya ionisasi. 1ev = 1.6X10-19 J. Jadi, dengan menggunakan keadaan eksitasi yang memadai, spektrasemua logam dapat diperoleh secara simultan.

17. Instrumentasi • Prinsipnya terdiri atas • (a) Sumber radiasi, • (b) Tempat sampel, untuk atomisasi, • (c) Monokromator, • (d) Detektor, dan • (e) Rekorder (read out)

19. Sumber radiasi: • Adaduamacamsumberradiasi, yaitu: • Sumberradiasikontinu : yaitusumberradiasi yang memancarkanradiasipadaberbagaipanjanggelombang. Contoh : Lampudeuteurium (D2) untuk UV, lampu wolfram (W) untuk visible. • Sumberradiasidiskontinu : yaitusumberradiasi yang memancarkanradiasisecaradiskontinu(padapanjanggelombangtertentu). Contoh : LampuKatodaCekung (Hollow Cathode Lamp, HCL), Electrodless Discharges Lamp (EDL).

20. Sumberradiasi yang paling banyakdigunakanuntukpengukuransecaraspektroskopiabsorpsi atom adalahlampukatodacekung (hollow cathode lamp/HCL). • HCL terdiriatasanoda tungsten (bermuatanpositif) dankatodasilindris (bermuatannegatif) dimanakeduaelektrodatersebutbberadadidalamsebuahtabunggelas yang diisidengan gas neon (Ne) atauargon (Ar) dengantekanan 1-5 torr. • Umumnya gasyang digunakanadalahArgonkarenamassanyalebihbesaruntukmemungkinkanterjadinyakabut (sputtering)danpotensialeksitasinyalebihbesaruntukmemungkinkanterjadinyagarisresonansi

22. Yang paling lazim digunakan utk AA. • Ionisasi gas inert pd potential tinggi. • Kationsgas menyebabkan atom logam mengemisikan radiasi spesifik dan kabut.

23. Katodatersebut terbuat darilogamataudilapisilogamdariunsur yang dianalisis. UmumnyaHCL dibuathanyauntukanalisissatuunsursaja. Akantetapisaatiniterdapatkatoda yang terbuatdaricampuranbeberapalogamsehinggasebuah HCL dapatdigunakanuntukanalisislebihdarisatuunsur.

24. PrinsipKerjaLampuKatodaCekung • Karenapengaruhtegangan yang tinggiantarelektroda (katodadananoda) makaakanterjadieksitasi gas pengisi (adajuga yang terionisassi). • Karenapengaruhtegangan yang tinggiantarelektroda (katodadananoda) makaakanterjadieksitasi gas pengisi (adajuga yang terionisassi). • Ar------> Ar* sertaadajuga yang terionisasi: Ar------> Ar+ + 1 • Ion Ar+ akanmempunyaienergikinetikyanggtinggisehinggasebagiandariAr+ akanmenujukatodadenganenergikinetik yang besar yang berakibatlepasnya atom-atom logampadapermukaankatodadidalamrongga. Padaprosesinidihasilkansuatukabut atom yang disebutsputtering. Sebagiandarikabut atom beradadalamkeadaantereksitasidanmemancarkanradiasiemisipadawaktu atom-atom logamkembalikepermukaankatoda (keadaandasar). M* ------> M + hν

25. Wadah sampel, untuk proses atomisasi (Atomizer) • Atomizer adalah piranti (device) untuk mengubahmateri/sampelmenjadi atom-atom bebas. Karena umumnya atom-atom beradadalamkeadaanberikatanpadasuhurendah, makaumumnyamelibatkansuhutinggi tetapi harus dikendalikan agar tidak terjadi ionisasi • Tujuan : untukmembuatrasio Ni/No sekecilmungkin, agar atom padaground statejauhlebihbesar (No >>> Ni) • Makin rendahsuhumakauntukmemproduksi atom padaground state makinbaik. • Atomizer yang banyak digunakan secara luas adalah nyala (flame). Untuk ini pemilihan bahan bakar dan pengoksida harus diperhatikan karena mempengaruhi suhu nyala. Selain itu, nyala dengan asetilen dan dinitrogen oksida sering memberikan emisi “background” yang nyata. Emisi ini dapt dihindarai dengan “choper” (pemotong radiasi).

26. Kelemahan Spektroskopi Nyala Atom • Hanya larutan yang dpat dianalisis • Memerlukan sampel relatif besar (1 – 2 mL) • Kurang sensitif (dibanding tungku grafit) • Ada masalah dg refractory elements • Keuntungan • Tidak mahal (peralatan dan pelaksanaannya) • Bisa utk jumlah sampel banyak sekaligus • Mudah penggunaannya • Presisi tinggi

27. Contoh suhu nyala : • Bahan bakar Oksidan Suhu (K) • Asetileneudara 2400 – 2700 • asetilene oksigen 3300 – 3400 • asetilene nitrous oxide 2900 – 3100 • hidrogen udara 2300 – 2400

28. Atomisasi tanpa nyala (Flameless atomization) Graphite furnace (tungku grafit)

29. Ada 3 tahap proses: (i) drying (pengeringan), 1250 C selama 20 det.(ii) ashing (pengabuan), 12000 C selama 60 det. dan (iii) atomizing (pengatoman), 27000 C selama 10 det.. Catatan: • sampel ditempatkan dalam tabung karbon (grafit) dan dipenaskan dengan listrik (tungku grafit) • waktu lebih lama, kepekaan dan batas deteksi mesti ditingkatkan • Sampel padat dapat dianalisis dengan cara ini

30. Detection Limit • absorbance • peak to peak noise level • The concentration of an element that gives a signal • equal to three times the peak to peak noise level of the base line • Measure the baseline while aspirating a blank solution

31. Monochromator • AdaperbedaannyataantaraAES (emisi)/AAS (absorpsi) denganspektroskopimolekul, yaitupadaletakmonokromatornya. • Padaspektroskopimolekul , sumberradiasidilewatkanmelaluimonokromatorbarukemudianmelewatisampel, sedangpada AES/AAS, sumberradiasimelewatisampelbarukemudianmasukkemonokromator. • Perananmonokromatordalamspektroskopi atom adalahuntukmengisolasigarisspektradarigarsi-garisspektra yang lain, tidakuntukmembuatsinarpolikromatismenjadimonokromatis.

32. Lanjtan ...... • Untuk memisahkan garis spektra yang dikehendaki dari lampu HCL atau multi-elemen yg mengemisikan banyak λ • Olehkarenaitumonokromatordalamspektroskopi atom lebihsederhanadaripadadalamspektroskopimolekul yang menggunakankombinasiprisma, grating dancerminataulensa. Bahkanada yang hanyamemakai filter saja (untukbeberapaspektrometer). • Kebanyakan instrumen dilengkapi dg “chopper” dua grating yg meliputi λ antara 189 sampai 851 nm yg digunakan pada absorbsi atom. • Penggunaan choper utk membedakan 2 sumber radiasi dari lampu dan nyala

33. Interferensi/Gangguan • Dalamteknikanalisisdenganspektroskopiabsorpsi atom dijumpaiduajenisinterferensiyaitu, interfrensispektradaninterferensikimia. Interferensispektraterjadibilaspektraabsorpsibahanpengganggubertumpangtindih (overlap) atauterletakdekatsekalidenganspektraanalat yang tidakmungkindipisahkandenganmonokromator. Interferensikimiadisebab-kandariterbentuknyaberbagaiproses • InterferensiSpektra • DalamSpektrokopiabsorpsi atom sangatjarangterjadiinterferensi yang disebabkantumpangtindihnyagarisemisispektrakarenagarisemisidari HCL sangatsempit. Interferensispektraakanterjadijikaselisihduagarisemisikurangdari 0,1 A. Misal V pada 3082,11 A dengan Al pada 3082,15 A. • Interferensiinidapatdiatasdenganmenggunakanpanjanggelombang yang lain seperti 3092,7 A untuk Al ataudenganmenghilangkan V terlebihdahulu. Interferensispektrajugadihasilkanolehadanyaprodukpembakaran yang mempunyaispektraabsorpsilebaratauproduk yang radiasiterpencar.

34. Interferensi Kimia • Interferensikimialebihumumterjadidaripadainterferensispektra. • Proses yang menyebabkaninterferensikimiaadalah • akibat pembentukansenyawadenganvolatilitasrendah:(1) analisis Ca karenakenaikankonsentrasisulfatataupospat, dan(2) Al dalamanalisis Mg, karenaterbentuknya Al/Mg oksida yang stabil • Akibat kesetimbangandisosiasi (adanya oksida dan hidroksida alkali), danionisasidalamnyala (jika digunakan oksigen atau N2O; jika digunakan udara tdk terjadi interferensi).

35. Pembentukansenyawadenganvolatilitasrendah • Kemungkinanterjadinyainterferensi yang paling umumadalahdisebabkanolehterbentuknyasenyawa (dari anion dananalat) denganvolatilitasrendahsehinggalajuatomisasimenjadiberkurang. Berkurangnyalajuatomisasimenyebabkanhasil yang diperolehmenjadirendah. • Sebagaicontoh : penurunanabsorbanssidalamanalisis Ca karenakenaikankonsentrasisulfatataupospat. Penurunanabsorbansiinisekitar 30-50% sampairasio anion (sulfat/pospat) terhadap Ca 1 : 2. Interferensikarenakationadalah Al dalamanalisis Mg, karenaterbentuknya Al/Mg oksida yang stabilterhadappanas yang mengakibatkanhasilanalisis Mg menjadirendah.

36. Pengatasan interferensi :(i) denganmenggunakannyaladengansuhu yang lebihtinggi. • (ii) penambahanreleasing agentyaitusuatukation yang mudahbereaksidenganinterferensehinggadapatmencegahinteraksidengananalat. • Contoh : penambahan ion Sratau La akanmemperkecilinterferensipospatdalamanalisis Ca, juga ion Sratau La sebagaireleasing agentpadaanalisis Mg denganadanya Al. • (iii) Penambahanprotective agentyaitusuatupereaksi yang dapatmencegahpembentukansenyawastabiltapivolatilseperti EDTA, APDC dan 8-hidroquinolin. Denganpenambahan EDTA, makainterferensi Al, Si, pospatdansulfatdalamanalisis Ca dapatdikurangi.

37. KesetimbanganDisosiasi • Dalamnyala, reaksidisosiasimenyebabkansenyawalogamdiubahmenjadiunsur-unsurnyaberbentuk gas. Reaksiinidalamkeadaansetimbang : • MO ⇄ M + O • M(OH)2 ⇄ M + 2 OH ataulebihumum • MA ⇄ M + A • Reaksidisosiasioksidadanhidroksidalogamsangatmempengaruhispektraabsorpsidanemisi. Oksidalogamdanhidroksidalogamdarilogam alkali lebihmudahterdisosiasisehinggaintensitasgarisspektratinggi (absorbansitinggi) sekalipunpadasuhu yang relatifrendah.

38. IonisasiDalamNyala • Ionisasi atom dalamnyaladenganudarasebagaioksidandapatdiabaikan. Akantetapijikamenggunakanoksigenatau N2O sebagaioksidanmakakemungkinanterjadiionisasisangatbesar. • Apabilabanyak atom yang terionisasidalamnyalamakaabsorbansi yang teramatiakanberkurang. • Untukmengatasiinterferensiionisasidapatdilakukandenganmenggunakansuhunyala yang lebihrendahsertapenambahanlogam alkali denganpotensialionisasi yang rendah.

39. SENSITIVITAS DAN BATAS DETEKSI • Dalamspektroskopiabsorpsi atom terdapatduaistilah yang perludiperhatikanyaitusensitivitasdan limit deteksi. Jikasuhu yang digunakanterlalutinggimakasensitivitasnyamenurunkarena atom-atom akanterionisasilebihlanjut. Ionisasilebihlanjutinipadasuhutinggidapatdiatasidenganpenambahansenyawa yang lebihmudahterionisasi (senyawagolongan alkali) dalamsampel. • Sensitivitasditentukansebagaikonsentrasidarisuatuunsurdalamng/mLatauppm yang menghasilkan signal transmitanssebesar 0,99 atau signal absorbansisebesar 0,0044 sedangkan limit deteksiditentukansebagaikonsentrasiterendahdarisuatu yang menghasilkan signal samadengandua kali standardeviasi signal backgroundataudua kali daribaseline noise. • Baiksensitivitasmaupun limit deteksinilainyabervariasidankeduanyatergantungpadasuhunyala, tipeinstrumen, danmetodeanalisis

40. Tehnik analisis SSA • Salahsatukeuntungananalisisdenganspektroskopiabsorpsi atom adalahtidakperludilakukanpemisahanunsur yang satudarilainnya. Larutansampeldapatlangsungdianalisiskandunganunsurnya

41. Penyiapan Sampel • Penyiapan sampel sebelum pengukuran tergantung dari jenis unsur yang ditetapkan, jenis substrat dari sampel dan cara atomisasi. • Pada kebanyakan sampel hal ini biasanya tidak dilakukan bila atomisasi dilakukan menggunakan batang grafit secara elektrotermal karena pembawa (matriks) dari sampel dihilangkan melalui proses pengarangan (ashing) sebelum atomisasi. • Pada atomisasi dengan nyala, kebanyakan sampel cair dapat disemprotkan langsung ke dalam nyala setelah diencerkan dengan pelarut yang cocok.

42. Sampel padat biasanya dilarutkan dalam asam teta adakalanya didahului dengan peleburan alkali. • Asam klorida, asam nitrat, dan asam sulfat biasanya digunakan untuk melarutkan logamlogam atau logam campur. • Asam nitrat biasanya membentuk senyawa yang mudah terurai tetapi sukar menguap sehingga ia lebih disukai daripada asam klorida untuk pengarangan. • Campuran asam nitrat, asam sulfat, dan asam perklorat (3:1:1) sangat berguna untuk oksidasi basah terhadap senyawa-senyawa organik.

43. Perlu diingat bahwa asam-asam pereaksi mungkin mengandung pengotoran-pengotoran logam seperti Cr pada asma nitrat, Pb pada asam klorida dan Cd pada asam sulfat. • Pelarut organik dapat digunakan untuk menyari logam-logam secara selektif setelah pembentukan kompleks dalam larutan air, lalu sari tersebut dapat langsung disemprotkan ke dalam nyala. • Pelarut organik yang biasa digunakan adalah metil isobutil keton (MIBK) dan etil asetat.

44. Standar • Larutan sampel dan standar sedapat mungkin harus sama. • Pereaksi yang digunakan harus bebas dari unsur yang ditetapkan. • Standar dan sampel harus disimpan dalam botol plastik polietilen karena beberapa logam terserap pada permukaan gelas. • Standar dengan konsentrasi rendah (kurang dari 1 ppm), harus dibuat baru dari larutan persediaan yang lebih pekat untuk menghindari kesalahan karena adsorbsi.

45. MetodeKurvaKalibrasi • Denganmembuatsederetanlarutanstandardengankonsentrasi yang telahdiketahuisecarapastidiukurabsorbansinya, kemudiandibuatkurvahubungan antaraabsorbansi versus konsentrasi yang akandiperolehgaris linier. Konsentrasisampeldapatdihitungdengancaramengeplotkanabsorbansi yang terukurdalamkurva. • Menuruthukum Beer absorbansiberbandinglurusdengankonsentrasi, namundemikianpadakenyataannyapenyim-panganseringterjadi. Untukmenghindarihalini,makakurvakalibrasiharusdibuatsetiap kali analisis.

46. MetodePenambahanBaku(Standrad Addition Method) • Dalamteknikinilarutansampeldengan volume yang samadimasukkankedalammasing-masinglabutakar, kemudianditambahlarutanstandardengankonsentrasi yang berbeda. Absorbansidarimasing-masinglabutakardiukursetelahdiencerkansampai volume tertentu (tandatera). Kemudiandibuatkurvahubunganantaraabsorbansi total dengankonsentrasistandar. • Diperolehhubungan : • AX = k CX • AT = k (CS + CX) • dimana • CX = konsentrasiunsurdalamlarutansampel • CS = konsentrasiunsurdalamlarutanstandar yang ditambahkan • AX = absorbansilarutansampel • AT = absorbansilarutansampeldanstandar

47. Contoh perhitungan • Penetapak kadar Ca dan Mg dalam cairan hemodialisis, sbb. • Sampel dilarutkan dalam asam nitrat 0,1 M untuk menghindari terbentuknya logam hidroksida, selanjutnya dilakukan hal-hal sbb. • Dibuat larutan baku yang mengandung 10,7 mg Ca dan 11,4 mg Mg/100 ml dalam air. • Diambil 10,0 ml larutan di atas lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100,0 ml dan diencerkan sampai tanda

48. Dibuat seri konsentrasi baku dengan melakukan pengenceran sbb. • Vol yg diambil vol akhir Serapan Ca serapan Mg • 0 ml 100 ml 0,002 0,005 • 5 100 0,154 0,168 • 10 100 0,310 0,341 • 15 100 0,379 0,519 • 20 100 0,619 0,585 • 25 100 0,772 0.835

49. Berapa konsentrasi Ca dan Mg dalam cairan dialisis (mmol/L), menggunakan data berikut. • Larutan hemodialisis diencerkan dari 5 ml ke 250 mL sblm analisis Ca • Larutan hemodialisis dari 10 ml diencerkan ke 100 mL • Pembacaan absorbansi atom Ca dlm sampel yg telah diencerkan = 0,343 • Pembacaan absorbansi atom Mg dlm sampel yg telah diencerkan = 0,554

50. Perhitungan • Konsentrasi baku Ca = 10,7 mg/mL. Pd awalnya lart baku diencerkan 10 kali (dari 10 mL ---> 100 mL). -----> [Ca] =1,07 mg/mL. Selanjutnya larutan diencerkan lagi dari 5 ml menjadi 100 mL. Jadi ada pengenceran 20x. ----> konsentrasi baku = 1,07/20= 0,0535 mg/100 mL. • Untuk pengambilan selanjutnya, konsentrasi baku diperoleh dengan mengalikan 0,0535 mg/100 mL dengan faktor 2, 3, 4, 5 sehingg didapatkan kadar Ca 0,107, -,165, 0,214, dan 0,2675 mg100 mL. Selanjutnya dicari persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi (x) vs absorbansi (y): dipeoleh persamaan Y = 2,664 x – 0,007