Mikroorganismu gēnu inženierija

1. Mikroorganismu gēnu inženierija 2013./2014. mācību gada 2. semestris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. Kursa struktūra • Kursa apjoms - 4 kredītpunkti; 32akad. stundas - lekcijas; 4 akad. stundas - divi kontroldarbi: - viens pēc GI eksperimentu apskata, - otrs par atsevišķu Vektoru pielietojumu; 28akad. stundas praktiskie darbi: - semināri, darbs pie datora, * Patstāvīgi sagatavoti ziņojumi semināros, atrisināti uzdevumi un veikta GIeksperimenta datorsimulācija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Kursa struktūra • praktiskie darbi: -datorklasē; 2. kursam - trešdienās 14:30 3. kursam - piektdienās 8:30 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Kursa struktūra • Definīcijas, vēsture, nozīmīgākie atklājumi, slavenākie zinātnieki pasaulē un Latvijā. GI ētiskie aspekti un drošības tehnika • GI eksperimentu shēma. GI izmantojamie enzīmi. Klonējamās DNS iegūšana, vektormolekulas • Gēnu bibliotēku veidošana • Saimniekšūnu ģenētiskā fona nozīme DNS fragmentu klonēšanā • Svešu gēnu ekspresijas iegūšana mikroorganismos un rekombinanto proteīnu izdalīšana un attīrīšana • Dažādu mikroorganismu grupu gēnu inženierija (grampozitīvās un gramnegatīvās baktērijas, raugi) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Literatūra I • Lekciju konspekti - \\Priede\Grozs\Mikrobiologijas...\ Maris\Gen-inz • Watson et al. Recombinant DNA. 2nd ed. 1992, Sci. Am. Books vai • Уотсон и др. Рекомбинантные ДНК. 1986, Мир • Lewin, B. Genes VI. 1997, OUP • Щелкунов С. Генетическая инженерия. 2004, Сиб. унив. изд. • Jebkura mikrobioloģijas, bioķīmijas un molekulārās bioloģijas grāmata - ievadam Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Literatūra II • Karcher, S.J. Molecular Biology. A Project Approach. 1995, Academic Press • Bloom et al. Laboratory DNA Science. 1996, Benjamin Cummings • Reed et al., Practical Skills in Biomolecular Sciences. 1998, Longman • Maniatis et al., Molecular Cloning. 1982, CSH • Short Protocols in Molecular Biology. Ed. in Chief Ausubel, F., 1995, Wiley Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Literatūra III • Basic Cloning Procedures. Ed. Bērziņš, V., 1998, Springer • Zinātniski žurnāli fakultātes bibliotēkā un katedrās - Nature, Science, Trends in … • Enciklopēdijas, piemēram, MS Bookshelf, MS Encarta, Encyclopaedia Britannica, Wikipedia u.c. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Literatūra IV • Enciklopēdijas, piemēram, MS Bookshelf, MS Encarta, Encyclopaedia Britannica, Wikipedia u.c. • http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookTOC.html Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Literatūra V INTERNETS • Nacionālais biotehnoloģijas informācijas centrs (ASV) - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ • Eiropas bioinformātikas institūts (AK) - http://www.ebi.ac.uk • Dažādu universitāšu kursu apraksti, lekciju konspekti, laboratorijas protokoli, metodes. Tas viss atrodams izmantojot kādu no meklētājiem - Google u.c. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10.  Gēnu inženierija Austrumeiropā populārs apzīmējums Rietumos biežāk lieto: Rekombinantās DNS tehnoloģija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11.  Definīcijas Encyclopaedia Britannica: Mākslīga manipulācija ar DNS un citām nukleīnskābēm, kā arī to modifikācija un rekombinācija, lai modificētu organismus vai to populācijas. MS Encarta: Gēnu inženierija ir organisma ģenētiskā (iedzimtības) materiāla izmainīšana, lai atbrīvotos no nevēlamām pazīmēm vai arī lai radītu jaunas vēlamas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12.  Definīcijas The American Heritage Dictionary of the English Language, 3rd Ed. 1996, Houghton Mifflin: Zinātniska dzīva organisma ģenētiskā materiāla struktūras izmainīšana. Tā ietver rekombinantu DNS molekulu radīšanu un izmantošanu, un ir tikusi pielietota baktēriju radīšanai, kas sintezē insulīnu un citus cilvēka proteīnus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13.  Definīcijas • Gēnu inženierija nav zinātne • Gēnu inženierija ir molekulārās bioloģijas, bioķīmijas, mikrobioloģijas, imunoloģijas un virusoloģijas metožu kopums . . , lai Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14.  Definīcijas • Iegūtu: eksperimentam vajadzīgo izejmateriālu, rekombinantas nukleīnskābju molekulas, rekombinanto DNS nesošas šūnas, pārliecinātos par iegūto rezultātu, iegūtu biotehnoloģiski nozīmīgus organismus ar jaunām īpašībām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15.  Definīcijas • GI metodes pielieto daudzās zinātnes nozarēs, tai skaitā arī zooloģijā, botānikā, fizioloģijā, medicīnā, lauksaimniecībā, biotehnoloģijā, mikrobioloģijā utt. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16.  Dabīga gēnu aprite dabā Nodrošina organismu ģenētisko daudzveidību un mainību: • Dzimumprocess • Rekombinācijas • Mutāciju rašanās • arī ģenētiskā transformācija, transdukcija Mākslīga un mērķtiecīga iejaukšanās – - gēnu inženierija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17.  Dzimumprocess • Dzimumprocess - vecāku ģenētiskā materiāla skaldīšanās un apvienošanās Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18.  Dzimumprocess Mejoze Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19.  Genoma kopiju skaits Prokariotiem raksturīgi:nosacīti 1 hromosomas 1 kopija šūnā (haploīds genoms) Plazmīdas, episomas - var nebūt / var būt, - ja ir - viena veida vai vairākas dažādas, - kopiju skaits mainīgs. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20.  Genoma kopiju skaits Deinococcus radiodurans Ginesa rekordu grāmatā ierakstīta kā izturīgākā baktērija uz pasaules. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21.  Genoma kopiju skaits • Deinococcus radiodurans • Genomu veido divas cirkulāras hromosomas: • 2,65 106 bp, • 412 Kbp • kā arī viena 177 Kbp liela megaplazmīda un • 46 Kbp plazmīda. • Genomā ir aptuveni 3 195 gēni. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22.  Genoma kopiju skaits Deinococcus radiodurans Stacionārjā fāzē esošajās šūnās parasti ir - 4 genoma kopijas, bet šūnās, kuras strauji dalās, pat - 8 - 10 genoma kopijas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23.  Genoma kopiju skaits Deinococcus radiodurans Lielo mikroorganisma izturību nodrošina: - daudzās genoma kopijas, kā arī - īpatnējs DNS reparācijas mehanisms (spēj pārrāvumus hromosomās atjaunot 12-24 stundu laikā). Tāpat D. radiodurans šūnās atrastas arī proteīnu sistēmas, kuras no jonizējošā starojuma iedarbības sargā pārējos proteīnus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24.  Genoma kopiju skaits Deinococcus radiodurans - daudzās genoma kopijas, un - īpatnējs DNS reparācijas mehanisms nodrošina homoloģiskās rekom- binācija starp identiskajām geno- ma kopijām, kā rezultātā iespē- jams atjaunot nopietni bojātu (fragmentētu) genomu. Zahradka k. et al. (2006) Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus radiodurans // Nature. 27 September 2006 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25.  Rekombinācija Homologā, simetriskā Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26.  Mutāciju rašanās Nelielā skaitā (fona līmenī): dabisks process kam pamatā - - DNS polimerāzes pieļautās kļūdas, kuras rada nukleotīdu spēja īslaicīgipastāvēt tautomērās formās. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27.  Gēnu inženierija • DNS fragmentu mākslīga pārnese - starp jebkuriem organismiem, nosakot pārneses sākumu un beigas, arī pievienojot sintētiskus DNS fragmentus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28.  • ģenētisko un molekulāro mehanismu izprašana. Gēnu inženierijas attīstības priekšnosacījums: Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29.  Kas atvieglo gēnu inženierijas veikšanu ? • Molekulāro mehanismu universālums visā dzīvajā dabā: - Ģenētisko informāciju kodē nukleīnskābes, - Ģenētiskā koda principu vienveidība, - Visi proteīni veidoti no 20 aminoskābēm, - Līdzība ģenētiskā materiāla darbības pamatmehanismos - replikācijā, transkripcijā translācijā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. GI priekšvēsture I Gregor Mendel (1822-1884) Liek pamatus ģenētikai kā kvantitatīvai zinātnei Koncepcija par pazīmi (gēnu) kā diskrētu vienību, kas tiek nodota no paaudzes paaudzei iedzimtības ceļā Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. GI priekšvēsture II Thomas Hunt Morgan (1866-1945) Izstrādā iedzimtības hromosomu teoriju - gēni ir lineāri novietoti noteiktās hromosomās un var būt savstarpēji saistīti (linkage) Rekombinācija starp diviem viena hromosomu pāra gēniem meijozes laikā liecina par to savstarpējo attālumu un novietojumu Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. GI priekšvēsture III Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. GI priekšvēsture IV 1944. gadā O.T. Avery, C.M. MacLeod un M. McCarty pierāda, ka DNS ir šūnas ģenētiskais materiāls. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. GI priekšvēsture IV Viņi turpina F. GriffithiesāktosStreptococcuspneumoniae transformācijas pētījumus. Transformāciju bloķē šūnu ekstraktu apstrāde ar - dezoksiribonukleāzēm, bet - nevis apstrāde ar proteāzēm vai - ribonukleāzēm. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. GI priekšvēsture V Alfred D. Hershey un Martha Chase 1952. gadā pārliecinoši pierāda, ka iedzimtības materiāls ir DNS. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36. GI priekšvēsture V Eksperimenti ar bakteriofāgu T2. DNS tika radioaktīvi iezīmēta ar 32P, bet fāga proteīnu apvalks ar 35S. Tikai vīrusa DNS nonāca šūnā un nodrošināja vīrusa vairošanos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37. GI priekšvēsture VI No kreisās:James Watson (1928-) un Francis Crick (1916-2004) Izstrādā DNS dubultspirāles modeli neveicot nevienu pašu eksperimentu. (1953) Viņu modelis tiek izstrādāts balstoties uz citu zinātnieku eksperimentālajiem datiem. (1962) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38. GI priekšvēsture VI 50 gadi (2003) DNS struktūras atklāšanai Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39. GI priekšvēsture VII Linus Pauling, Rosalind Franklin, Maurice Wilkins, Erwin Chargaff Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

40. GI priekšvēsture VII Rosalind Franklin (1920 - 1958) R.F. DNS kristalogrāfijas un rentgenstaru difrakcijas dati ir pamatā Vatsona un Krika DNS dubultspirāles modelim R.F. tiek uzskatīta arī par vīrusu struktūras pētījumu pamatlicēju Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

41. GI priekšvēsture VIII Robert Holley (1922-1993), Marshall Nirenberg(1927-2010) un HarGobind Khorana(1922-2011) līdz 1966. gadam pilnībā atšifrēģenētisko kodu. (1968) http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1968/khorana.html http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1968/holley.html Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

42. GI priekšvēsture VIII Ģenētiskā koda atšifrēšanai izmanto in vitro translāciju par matricas RNS izmantojot sintētiskas RNS ar noteiktu nukleotīdu tripletu secību Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

43. GI attīstība Latvijā I Molekulārās bioloģijas un ģenētikas attīstība Latvijā atsākās 1964. gadā, kad PSRS PSKP CK oktobra plēnumā tika atcelts ģenētikas un molekulārās bioloģijas aizliegums, kas tika ieviests laikā, kad Trofims Lisenko bija PSRS Zinātņu Akadēmijas Ģenētikas institūta un Ļeņina vārdā nosauktās Vissavienības Lauksaimniecības Zinātņu akadēmijas direktors (1940 - 1965) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

44. GI attīstība Latvijā II • 1964. gadā Elmārs Grēns LZA Organiskās sintēzes institūtā nodibina nukleīnskābju pētījumu grupu, • 1975. gadā tā tiek pārveidota par laboratoriju, • bet 1988. gadā par nodaļu, kas ietver 3 laboratorijas, • 1990. gadā izveidojas Molekulārās bioloģijas institūts, • kas 1993. gadā tiek pārveidots par LU Biomedicīnas pētījumu un studiju centru. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

45. GI attīstība Latvijā III Prof. Elmārs Grēns Prof. Valdis Bērziņš Prof. Pauls Pumpēns Prof. Aleksandrs Cīmanis Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

46. GI attīstība Latvijā IV • Ar gēnu inženieriju Latvijā sāk nodarboties 1978. gadā • 1980. gadā tiek klonēts pilns hepatīta B vīrusa genoms • 1984. gadā tiek atklāts jauns cilvēka interferona gēns IFN-aN • 1985. gadā tiek noteikta pilna HBV genoma struktūra • 80 - 90-tie gadi - cilvēka interferonu un interleikīnu gēnu klonēšana un ekspresija E.coli šūnās Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

47. GI attīstība Latvijā V Pētniecības iestādes, kurās izmanto GI metodes: • LU Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs • LU Bioloģijas fakultāte • (A. Kirhenšteina) Mikrobioloģijas un virusoloģijas institūts • LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas institūts Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

48. GI attīstība Latvijā Ieteicamā literatūra: Intervija ar profesoru Paulu Pumpēnu krājumā Millenium. Skats uz Latviju. Valters un Rapa, 1999 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

49. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML