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第十三章 遗传工程 （ genetic engineering ）

第十三章 遗传工程 （ genetic engineering ）. 教学目的与要求. 1. 理解基因工程和基因组学的概念和应用 2. 掌握内切酶的类别和作用 3. 掌握重组 DNA 技术 4. 掌握基因的分离和鉴定方法 5. 理解基因组图谱的构建和应用 6. 了解后基因组学.

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第十三章 遗传工程 （ genetic engineering ）

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Presentation Transcript

  1. 第十三章 遗传工程（genetic engineering） 教学目的与要求 1. 理解基因工程和基因组学的概念和应用 2. 掌握内切酶的类别和作用 3. 掌握重组DNA技术 4. 掌握基因的分离和鉴定方法 5. 理解基因组图谱的构建和应用 6. 了解后基因组学

  2. 遗传工程又称遗传操作。广义的包括细胞工程、染色体工程和基因工程，狭义的仅指基因工程。是以遗传学特别是分子遗传学为理论基础，以现代物理学、化学等技术手段，按照人们设计的生物蓝图，在细胞、染色体和基因的不同水平上，对生物的遗传性进行定向的改造。遗传工程在人类健康和工业、农业、环境保护等方面有着广阔的应用前景。遗传工程又称遗传操作。广义的包括细胞工程、染色体工程和基因工程，狭义的仅指基因工程。是以遗传学特别是分子遗传学为理论基础，以现代物理学、化学等技术手段，按照人们设计的生物蓝图，在细胞、染色体和基因的不同水平上，对生物的遗传性进行定向的改造。遗传工程在人类健康和工业、农业、环境保护等方面有着广阔的应用前景。

  3. 细胞工程 • 是细胞水平的遗传工程，即应用细胞生物学和分子生物学方法，对细胞进行遗传操作，如细胞培养、细胞诱变、细胞融合、细胞重组、遗传物质转移和生殖工程等，以获得所期望遗传组成的细胞或生物体。细胞工程可应用于人类优生，微生物与植物育种，生产有用物质等。

  4. 细胞融合 • 在一定条件下，将两个或多个细胞融合成一个细胞的过程。 • 动物细胞的融合可利用病毒、溶血卵磷脂、显微操作等。现已实现人与鼠、人与兔、人与鸡、人与蛇、鼠与鸡、鼠与兔、鼠与猴、兔与鸡、鱼与艾氏细胞等的融合。 • 植物细胞的融合要先去壁、原生质体融合、然后进行杂种细胞筛选和鉴定，经杂种细胞培养可形成再生植株。

  5. 基因工程 • 又称基因操作、重组体DNA技术。为基因水平的遗传工程，是在分子遗传学等学科发展的基础上于20世纪70年代诞生的一种新的生物学技术。即按照预先的设计，首先获取含有目的基因的DNA片段，在体外与载体相拼接构成重组体DNA，将其导入受体细胞进行复制或表达，则可获得目的基因产物或表现有益性状。因此包括①目的基因的获得②运载体的选择③工具酶的使用④基因的拼接和表达四个方面。

  6. 目的基因的获得 • 物理化学法：依据碱基互补 • 密度梯度超速离心法 • 分子杂交法 • 单链酶法 需SI核酸酶 • 多赖氨酸法 • 酶促合成法 利用反转录酶合成cDNA→DNA • 化学合成法（见下图） • 生物学方法 “霰弹射击法”或“鸟枪法”（见图）

  7. 基因工程的工具酶 • 限制性核酸内切酶（ER）：是具有限制作用的内切核酸酶，用来降解未经特殊修饰的外源DNA，使细胞免受外源DNA的侵扰，故名。 • 专一性 • 识别序列和切割位点

  8. DNA聚合酶（DNA polymerase） • E.coli DNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ，其主要功能是缺口平移，pol Ⅰ打开缺口，5′→3′外切酶降解旧链， 5′→3′聚合酶合成新链并带入放射性标记。 • Klenow酶，具有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性，在基因工程中用于修补限制酶切片段的隐缩3′—末端、标记DNA片段、催化cDNA第二链合成和进行DNA序列测定。 • T4、T7、DNA聚合酶

  9. TagDNA聚合酶，具有5′→3′聚合酶活性，从喜温微生物Thermus aquaticus中分离，最适温度75-80 ℃，需Mg2+ • 反转录酶 如AMV • 末端转移酶 • RNA聚合酶 • 连接酶：T4、T7DNA；T4RNA；E.coliDNA • 核酸酶S1：一种特异性单链核酸内切酶，在适宜条件下降解单链DNA或RNA成平齐末端

  10. 载体（vector） • 在基因工程中，可与包括目的基因的外源DNA片段构成重组体，并能将重组体DNA导入受体细胞，使目的基因得以复制或表达的DNA。多由质粒、噬菌体、柯斯粒和真核生物的人工染色体构建。 • 载体的一般特点：①具有自主复制的复制子，拷贝数多②带有可检测的遗传标记③具有一种或几种限制酶的单一切点④分子量较小，容纳外源DNA的幅度较宽⑤便于遗传操作，并且在生物防护角度上是安全的。

  11. 质粒载体（plasmid vector） pBR322的结构特点： ①为松弛型复制控制质粒，拷贝数20-30，用氯霉素处理可达上千个拷贝 ②具有双抗选择标记Ampr、Tetr ③具有多种常用的限制性核酸内切酶单一切点

  12. λ 噬菌体载体 由λ 噬菌体DNA构建的载体。 λDNA为双链线状，约含49kb，分子量3.2×107d，于分子的5′和3′两端各有12个核苷酸的粘性末端cos以在寄主细胞中环化，分子中约有2/3的序列为裂解周期所必需，克隆容量极限为23kb。

  13. M13噬菌体载体： 由大肠杆菌丝状噬菌体M13构建。含6407个核苷酸的闭合环状单链。只感染有纤毛的雄性E.coli，很快变成RFDNA，经复制拷贝数可达100-200个/细胞。由于克隆位点位于LacZ基因，故在含IPTG和X-gal的培养基上筛选有外源DNA片段。

  14. Cosmid载体 Cosmid是“cos site-carrying plasmid”的英文缩写，由此可见，这种质粒是由λ 噬菌体的一部分（含有cos位点）和pBR322质粒载体经人工构建而成的。这就兼有了λ 噬菌体和质粒的优点

  15. Cosmid质粒载体的主要特点： ①具有包装限制和高效转导能力，这是λ 噬菌体的特性 ②具有质粒载体的特性，可在寄主细胞中复制，进行氯霉素扩增，并具有抗生素抗性或插入失活等选择标记 ③具有高容量克隆能力，可克隆至45kb的外源DNA，故特别适用于基因组DNA克隆。

  16. 本章小结 1. 遗传工程 载体条件与限制性内切酶；目的基因的获取与体外重组；转基因技术及其应用卵细胞工程中核移植与体细胞克隆技术 2. 基因组学 基因图谱构建：遗传图谱和物理图谱的构建； 基因图谱的应用：基因定位、比较基因组学、MAS、基因克隆； 后基因组学：蛋白质组学、功能基因组学、生物信息学

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