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Ex vivo gene delivery for stem cells of clinical interests using

Specific Targeted Research or Innovation Project. Ex vivo gene delivery for stem cells of clinical interests using synthetic processes of cellular and nuclear import and targeted chromosomal integration SyntheGeneDelivery 2006-2008. LEPG. 2.4 M €. Equipe Edward Smith (Suède)

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Ex vivo gene delivery for stem cells of clinical interests using

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Presentation Transcript

  1. Specific Targeted Research or Innovation Project Ex vivo gene delivery for stem cells of clinical interests using synthetic processes of cellular and nuclear import and targeted chromosomal integration SyntheGeneDelivery 2006-2008

  2. LEPG 2.4 M €

  3. Equipe Edward Smith (Suède) Bioplexe (PNA ciblage au noyau) Equipe Yves Bigot (France) Vecteur d’intégration site spécifique Equipe Bruno Pitard (France) Vecteur d’administration Lipoplexe-Block copolymère Vecteurs synthétiques : SyntheGene Transfert Equipe Dominique Wells (Angleterre) Equipe Ronald Chalmers (Angleterre) Transfection ex vivo de cellules souches dans un cadre de thérapie génique

  4. SyntheGeneDelivery Non-viral systems for ex-vivo gene transfer Transposon-based system Improved to bypass the biological barriers of the cell Site directed gene integration Safety is our leitmotiv…

  5. Transposase gene 5’ITR 3’ITR SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner Mos1 ?

  6. Mos1 Mariner

  7. ITR5’ ITR3’ TA TA ORF Transposase UTR3’ UTR5’ Mos1 ADN de 1286 pb • ITR de 28 pb • 4 différences entre ITR5’ et ITR3’ • Gène sans intron codant la Tnp (345 acides aminés) • Autonome

  8. ITR5’ ITR3’ UTR3’ UTR5’ ORF Transposase TA TA ATG polyA Mos1 Transcription du gène codant la Tnp ?

  9. Transcription du gène codant la Tnp ? ITR5’ ITR3’ UTR3’ UTR5’ ORF Transposase TA TA polyA Mos1 mRNA ITR Petit et al. 2006 Mos1

  10. HTH 345 1       D D 34 D Domaine de liaison à l’ADN Domaine Catalytique 3-D non connue 3-D connue Richardson et al. 2006 MgCl2 ou MnCl2 Feuillet  Hélice  Mos1 Traduction du messager codant la Tnp ? La Tpase est nécessaire et suffisante pour la transposition

  11. palindrome mirror Site symétrique Famille des protéines HTH Homodimère Hardwidge et al., 2002 CRO, CRP,  répresseur Qu’est ce que l’on sait sur HTH et ITR ITR Liaison Courbure 3

  12. Permutation circulaire In silico data Courbé rigide palindrome 1 2 3 4 5 6 Probes SEC2 SEC1 http://hydra.icgeb.trieste.it/dna/bend_it.html mirror Point de flexibilité Free probe ITR5’= ITR3’ Angle 90° ITR + Tnp ITR seul Fixation asymétrique du dimère de transposase 1/2 site différent Méthode aléatoire Capacité de courbure ? Fonctionnement de la transposition 6

  13. minutes 0 5 15 30 60 C kDa 225 150 100 75 160 kDa WT (1-345) 83 kDa HTH       D D 34 D monomère / dimère cis-dimérisation Qu’est ce que l’on sait sur le comportement de Mos1 MONOMERE dimère

  14. 5’-TCAGGTGTACAAGTATGAAATGTCGTTT-3’ HTH HTH 3’-AGTCCACATGTTCATACTTTACAGCAAA-5’ D 34 D D D D 34 D TA Mos1: mécanisme de transposition Et après ??

  15. Complexe synaptique Excision Insertion TA Vecteur ?? Mos1: mécanisme de transposition Liaison à l’ADN « Exciser - réinsérer » « Couper - coller »

  16. Augé-Gouillou et al. 2001 Mos1: mécanisme de transposition Interaction Tnp/ITR ITR3’> ITR5’ Impact sur la transposition ? Mécanisme améliorable ?? Mécanisme régulé ??

  17. Plasmide source de Tnp • Production inductible Tnpi Pseudo-Mos1 • Plasmide donneur de transposon • 3Tet3 versus 5Tet3 • Tétracycline sensible avant transposition Mos1: mécanisme de transposition Test de transposition en bactéries. Promoteur « tagging » : Apparition de clones tétra R = Evénements de transposition F = Nb bact Tet R / Nb total bact Induction

  18. 10-2 10-3 Transposition frequency 10-4 10-5 10-6 10-7 25 28 32 37 Temperature (°C) Mos1: régulations Mécanisme régulé Mécanisme améliorable Régulation ?

  19. Tnp déP Tnp P Fréquence de transposition in vitro ITR3’ Tnp P Tnp déP minutes Mos1: régulations Mécanisme régulé Mécanisme améliorable Tnp protéine eucaryote. Modifications post-traductionnelles ? Régulation ?

  20. Transposon • Ubiquiste • Simple • Améliorable Mos1: vecteur de demain… Vecteur !! SyntheGeneDelivery

  21. Transposase gene 5’ITR 3’ITR Chromosome SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner Mos1

  22. Transposase gene 5’ITR 3’ITR SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner mos1

  23. Transposase gene 5’ITR 3’ITR SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner mos1 Simple and small DNA molecule (1300 bp) Active in different cell types

  24. Transgene 5’ITR 3’ITR SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner mos1 Transposase supplied in trans Plasmid mRNA Protein Transgène = gène médicament / thérapie cellulaire

  25. 3 - Enter into the chromosome 1 - Enter into the cell 2 - Enter into the nucleus + Transposase SyntheGeneDelivery Ex vivo All synthetic, non-viral components

  26. + Transposase SyntheGeneDelivery: 1- To enter into the cell ev-Synthetic gene delivery systems BGTC-Dope

  27. SyntheGeneDelivery: 1- To enter into the cell ev-Synthetic gene delivery systems In Cell Art (Bruno Pitard) yes yes

  28. DNA-NLS SV40 NLS: on plasmids backbone + Transposase SyntheGeneDelivery: 2- To enter into the nucleus Bypass the nuclear membrane: NLS LEPG - Tours (Yves Bigot)

  29. Bioplex (PNA + NLS):coupled to plasmids backbone + Transposase NLS SyntheGeneDelivery: 2- To enter into the nucleus Bypass the nuclear membrane: NLS Avaris AB (Elisabeth Törnquist) Karolinska Institutet (Edvard Smith)

  30. + Transposase SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome

  31. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome + Transposase

  32. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome + Transposase

  33. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 efficiency Oxford Univ (Ronald Chalmers) LEPG -Tours (Yves Bigot)

  34. J3 boîte de pétri Transfection: J1 Composition des complexes transfectés : - un plasmide donneur de transposon (néo) - un plasmide donneur de transposase (+/-) - un agent transfectant (PEI) Sélection en G418 15 jours SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency TEST: Transfection of human cells (HeLa) Analyse des clones résistants à la Néo

  35. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells Fischer et al. 2001

  36. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells Wu et al. 2006

  37. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells Himar in vitro Himar en cellules humaines Keravala et al. 2006

  38. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells

  39. Petit et al. 2006 SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells Pas de Tnp = pas de transposition Régulation négative de la production de Tnp MOS1 ? Induction RNAi ?

  40. X 87 X 61 X 36 X 24 X 21 X 17 X 15 X 14 X 11 X 8 X 3 Transposition en bactérie SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Engineering the transposase and the vector Mutagenesis to obtain hyperactive and/or non-phosphorylable MOS1 Tnp

  41. 10-3 3T3 10-4 Transposition frequency 10-5 10-6 10-7 49 51 53 55 57 59 61 63 GC content (%) SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Engineering the transposase and the vector Mutagenesis to obtain hyperactive transposon sequence

  42. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Engineering the transposase and the vector Mutagenesis to obtain hyperactive transposon sequence (ITR/UTR)

  43. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Engineering the transposase and the vector + Tnp hyperactive (X 80) Amélioration d’un facteur ± 1200

  44. Insertion aléatoire : qualité des cellules obtenues ? Essais de Fisher avec les « enfants bulle » Leucémies… SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Target the insertion Program the integration site using the DNA binding specificity of a defined ZFD fused to the transposase.

  45. Principe : Zing Finger Domain 30 AA Structurés par un Zn Liaison spécifique triplet AcNucl SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Target the insertion ZFD fused Tnp

  46. Principe : Zing Finger Domain 30 AA Structurés par un Zn Liaison spécifique triplet AcNucl SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Target the insertion ZFD fused Tnp

  47. 4 x 3 pb = 12 pb. Séquence unique. SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Target the insertion ZFD fused Tnp Choix de la séquence « cible » pour l’intégration du transgène: 12 pb. Fabrication du ZBS correspondant / fusion avec la Tnp MOS1. Ciblage de l’intégration

  48. Mesenchymal stem cells (hfMSC) First trimester fetal blood - multipotentiality (differentiation) Therapeutic potential in utero transplantation Mesenchymal deficiency diseases Muscle stem cells Genetic muscle disorder Intramuscular graft = Factory cells SyntheGeneDelivery: 4- Transformation of stem cells Imperial College (Dominic Wells)

  49. SyntheGeneDelivery Analyses of transposition events Un événement de transposition « vraie » par cellule. Pas de recombinaison (présence trop ADN ou Tnp) Disparition du plasmide donneur de transposon. Disparition de la source de Tnp. Localisation de l’intégration. Southern blots = Choix des « bonnes » cellules

  50. SyntheGeneDelivery Analyses of transposition events

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