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GeneXpert MTB/RIF

GeneXpert MTB/RIF. GeneXpert MTB/RIF. teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid) permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB) baseado na técnica de PCR em tempo real. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

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Presentation Transcript

  1. GeneXpert MTB/RIF

  2. GeneXpert MTB/RIF • teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid) • permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB) • baseado na técnica de PCR em tempo real

  3. Reação em Cadeia da Polimerase(PCR) • Um das principais ferramentas de biologia molecular • Desenvolvidapor Kary Mullis em 1983, resultando no prêmio Nobel em Química

  4. Importância dos oligonucleotídeos iniciadores (primers) na síntese de DNA

  5. Melting 100 94 oC Temperatura 50 0 T e m p o 3’ 5’ 5’ 3’ PCR

  6. Melting 100 94 oC Temperatura 50 0 T e m p o 3’ 5’ PCR 94ºC 5’ 3’

  7. Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extensão Anelamento Temperatura 72 oC 50 oC 50 0 T e m p o 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ PCR

  8. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extensão Anelamento Temperatura 72 oC 50 oC 50 0 T e m p o 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ PCR 94ºC 94ºC

  9. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extensão Anelamento Temperatura 72 oC 50 oC 50 0 T e m p o 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ PCR

  10. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extensão Anelamento Temperatura 72 oC 50 oC 50 0 T e m p o 5’ 5’ 5’ 5’ PCR 94ºC 94ºC

  11. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extensão Anelamento Temperatura 72 oC 50 oC 50 0 T e m p o 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ PCR

  12. 30x Melting Melting 100 94 oC 94 oC Extensão Anelamento Temperatura 72 oC 50 oC 50 0 T e m p o 5’ 5’ 5’ Fragmentos de tamanho definido 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ PCR

  13. Mais Ciclos = Mais DNA Número de ciclos 0 10 15 20 25 30

  14. Amplificação 30 ciclos geram aproximadamente 109 moléculas Permite aumentar a quantidade de uma determinada amostra Pode aumentar a quantidade de um contaminante

  15. DNA polimerase de E. coli • Klenow (derivada da DNA Pol.I de E.coli) extensão desnaturação anelamento • DESVANTAGENS: Temperatura ótima baixa e não é termoestável

  16. Breve Histórico • O primeiro termociclador foi desenvolvido na Cetus Corp. – Mr Cycle • Projetado para que a DNA polimerase pudesse ser adicionada a cada ciclo

  17. Yellowstone National Park

  18. DNA Polimerase Termoestável • 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC

  19. • Várias enzimas isoladas desse microorganismo incluindo a primeira DNA polimerase termoestável Taq DNA polimerase (1976)

  20. Taq DNA polimerase – temperatura ótima de 72ºC e é estável até temperaturas superiores a 94ºC

  21. Kary Mullis Prêmio Nobel de Química em 1993

  22. Componentes de uma reação de PCR 1. Template (molde) (1–500 ng). 2. Primers (0.05–1.0 μM). 3. Mg2+ (0.5–5 mM). 4. dNTP (20–200 μMcada). 5. 1× PCR buffer 6. DNA polimerase (0.5–2.5 U para cada 50 μL de reação).

  23. PCR “padrão” • Permite amplificar uma determinada seqüência de DNA • Clonagem gênica • Sonda (northern blot, southern blot, hibridização in situ,...) • Seqüênciamento (identificação de amostra, análise filogenética, confirmação de transfecção)

  24. CURVA DE PCR

  25. GeneXpert (Cepheid)

  26. GeneXpert (Cepheid)

  27. GeneXpert MTB/RIF

  28. GeneXpert MTB/RIF

  29. Avaliação dos módulos

  30. Avaliação dos módulos

  31. Preparação da amostra

  32. Preparação da amostra

  33. Cartucho GeneXpert MTB/RIF

  34. Cartucho GeneXpert MTB/RIF

  35. Identificação do Cartucho GeneXpert MTB/RIF  Manual  Automática

  36. OPÇÕES DE UTILZAÇÃO

  37. Cancelamento de teste(s)

  38. Resultado – Amostra 1

  39. Resultado – Amostra 1

  40. Resultado – Amostra 2

  41. Resultado – Amostra 2

  42. Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose • Métodos bacteriológicos . Métodos Moleculares -Baciloscopia -24hs - Fita Hain 3 dias ou mais (baciloscopia positiva +) -Cultivo – MGIT – 10 dias - Genexpert -2hrs - Sólido – 30 dias - Teste de Sensibilidade - MGIT -15 dias - Método das Proporções 28 a 42 dias

  43. Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose Vantagens e Desvantagens -Bacteriológico - Moleculares(Genexpert) - Mais barato - Mais caro (baciloscopia) - TSA Mais demorado (MGIT) - Mais rápido Rif resit - Outras drogas (INH, etc.) - Só para Rif - Bacilos vivos - Bacilos Vivos e “mortos” - Cultivar para TSA confirmatório e outras drogas (quantidade de escarro) - Triagem - Três códons relacionados a resistência a RIF - Não detecta em amostras extra-pulmonares - Não detecata MNT

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