High Performance Liquid Chromatography

1. High Performance Liquid Chromatography HPLC CLAE Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência

2. 1. Introdução CROMATOGRAFIA = método físico de separação no qual os constituintes de uma amostra a serem separados são distribuídos entre 2 fases: • estacionária: geralmente de grande área, sólida ou líquida • móvel: um fluido insolúvel que percola através da primeira

3. FASE MÓVEL Fase estacionária injeção separação eluição DETECTOR

4. CROMATOGRAFIA SFC GC LC Cromatografia a Cromatografia a Cromatografia a FONTE: LOUGH & WAINER, 1997. Fluido Supercrítico Gás Líquido LC LC Planar Coluna CCD Coluna "Open Cromatografia Coluna Cromatografia Tubular" Capilar Papel Empacotada Camada Delgada d < 350 um c Coluna Capilar Coluna Coluna Coluna empacotada Microbore "Analítica" Preparativa d <= 350 um 350 um < d < 1 mm 1 mm < d < 8 mm d >= 8 mm c c c c

5. LC Clássica Fluxo por gravidade

6. HPLC Moderna* • Partículas da fase estacionária extremamente pequenas (diâmetro < 10 m)  bombas para operações a altas pressões (até 500 atm) e baixas vazões (0,01 a 2-3 mL / min) ........High Pressure LC • Solventes especiais e ultra-puros • Detectores seletivos e super-sensíveis, com tamanho de célula de detecção < 10 L

7. Reservatórios para os solventes Injetor Precoluna Bomba HPLC Coluna Analitica Sistema de Tratamento de Dados Detector Filtro em linha Scavenger HPLC Moderna*

8. Substâncias não analisáveis por GC: • compostos iônicos • sais inorgânicos e orgânicos • aminoácidos puros • compostos polares de alto PM • polímeros • compostos termicamente instáveis • corantes salinos • etc.

9. Proteínas Ácidos nucleicos Aminoácidos Corantes Polissacarídeos Pigmentos plantas Metabólitos plantas Produtos farmacêuticos Compostos iônicos Íons metálicos Cátions e ânions Lipídeos polares Complexos metais pesados Explosivos Polímeros sintéticos Aplicações HPLCSubstâncias químicas

10. Vantagens da HPLC • Sensível a diversas amostras, incluindo orgânicas, biomoléculas e íons - Pode-se analisar > 60% de todos os componentes contra uns 15% para GC • Alta resolução • resolve (separa) centenas de componentes em amostras complexas • Detecção de alta sensibilidade • detecta nos limites de pg - ng • Análises rápidas e precisas • análises de 1 - 60 min, precição de 1% RSD • Análises automatizadas • usando autosampler e sistema de tratamento de dados

11. 4. Modos de Separação • Cromatografia de adsorção (sólido-líquido) • Cromatografia de partição (líquido-líquido) • Cromatografia de troca iônica • Cromatografia por exclusão de tamanho

12. Fase Estacionária • Sólida • Apresenta na superfície cargas iônicas ou polares. Exemplos: • Sílica gel • Alumina • Florisil • Carvão • Carbonato de cálcio

13. Fase Móvel • Hexano • Isooctano • Cloreto de butila • Clorofórmio • Diclorometano • Tetraidrofurano • Acetonitrila • Iso e n-propanol • Metanol • Água

14. Fluxo apolar Cromatografia de Adsorção

15. Cromatografia de partição clássica FASE ESTACIONÁRIA • Fina camada de líquido que cobre as partículas de um suporte sólido • Este líquido pode ser: • polar: polietilenoglicol, ODPN (,´-oxidipropionitrila) • apolar: hexano FASE MÓVEL • Sempre de polaridade contrária • Baixa estabilidade

16. Cromatografia de partição com fases quimicamente ligadas FASE ESTACIONÁRIA • Líquido é quimicamente ligado ao suporte sólido. FASE MÓVEL • Sempre de polaridade contrária • Alta estabilidade

17. GRUPO FUNCIONAL ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO MODO Amino NH2 Ciano (nitrila) CN Si O CH2 CH CH2OH Diol O OH Si O CH2 CH CH2OH O OH Fases polares quimicamente ligadas frequentemente utilizadas FASE NORMAL

18. GRUPO FUNCIONAL ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO MODO CH3 Dimetil silil Si CH3 Octil silil Si CH2 (CH2)6 CH3 Octadecil silil Si CH2 (CH2)16 CH3 Fenil silil Si OH Fases apolares quimicamente ligadas freqüentemente utilizadas FASE REVERSA

19. apolar Fluxo polar polar Cromatografia de Partição

20. Cromatografia Fase Normal (NPC) x Cromatografia Fase Reversa (RPC) • Classificação baseada na Natureza da Fase Móvel • NPC • Fase móvel Apolar  hexano, isooctano • Fase estacionária Polar  sílica, alumina • RPC • Fase móvel Polar  metanol, água • Fase estacionária Apolar  C8, C18

21. Portanto.......... GERALMENTE: • NPC  Cromatografia Adsorção • RPC  Cromatografia Partição

22. FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos quimicamente ligados a um suporte (sílica ou polímeros de alto PM). Pode ser: trocadora de cátions: grupo iônico = sulfonato trocadora de ânions: grupo iônico = amônia quaternária FASE MÓVEL = soluções tampões (controle pH). Por exemplo: ácido cítrico, fosfato amônia, acetato sódio, borato sódio, etc. APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos, proteínas/peptídeos, etc 4.3. Cromatografia de troca iônica

23. + - SO Na 3 Suporte Polimérico ou de Silica pH - + Fluxo SO Na 3 Cromatografia de troca iônica

24. A separação é baseada no tamanho da molécula e não em fenômenos de interações físicas ou químicas FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro médio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas moléculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros médios, ou seja, são permeadas seletivamente. As moléculas grandes são excluídas  exclusão tamanho. 4.4. Cromatografia por exclusão de tamanho

25. FLUXO Gel Poro Cromatografia por exclusão de tamanho

26. t Injeção W W Resolução (Rs) Rs = tr1 - tr2 / wb Rs = separação real dos picos Rs = 0 (sem separação), Rs = 1 (separação parcial), Rs = 1.5 (separação da linha base)

27. 1. Colunas • Sistema separação (adsorção, partição, etc) • Comprimento (10-25 cm) • cromatografia rápida  3 cm • Diâmetro interno* • Tipo de suporte (sílica gel ou polímeros) • Grupos quimicamente ligados (amino, ciano, C8, C18, sulfonato) • Tamanho da partícula (3-20 m) • Tamanho do poro (60-300 Å)

28. Tipo de Coluna i.d. Capacidade de Velocidade (mm) amostra de Fluxo (mg) ( mL/min) Semi-preparativa 8-20 10-50 5-30 Analítica 4.6 1 1 Narrowbore 2.0 0.2 0.2 Microbore 1.0 0.05 0.05 Diâmetro da coluna

29. 2. Bombas / Fase Móvel • Velocidade fluxo • 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas • > 5,0 mL/min para colunas preparativas • Pressão operação • 500-2000 psi para colunas analíticas

30. Eluição Isocrática / Gradiente • ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda durante a corrida. • GRADIENTE = a composição da fase móvel varia de acordo com a polaridade dos analitos. Bomba binária/quaternária.

31. Da bomba Da bomba Amostra da seringa Para coluna Para coluna Descarte Loop Loop 3. Injeção da Amostra • INJETOR MANUAL

32. Corpo da Seringa Solvente Amostragem da Seringa Válvula de injeção Vials na bandeja Frasco de lavagem 3. Injeção da Amostra • AUTOSAMPLER

33. 4. Detectores • Equipamento com uma pequena célula de fluxo conectado na saída da coluna e que monitora a concentração dos analitos. • Detectores mais comuns: • UV/Vis (absorvância) • Fluorescência • Índice de Refração • Outros: Eletroquímico, Condutividade, Infravermelho, etc.

34. 4.1. Detectores UV/Vis e Rede de Diodos (DAD) • PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais são expostos à radiação, sofrem excitação eletrônica a qual resulta na absorção de energia em comprimentos de onda específicos para os grupos. • Comprimento onda: 210-380 nm  UV • Comprimento onda: 380-800 nm  Visível •  90% compostos orgânicos absorvem luz em algum lugar da região UV-Vis •  65% das amostras analisadas por LC absorvem luz na região de compr. Onda = 254 nm

35. Detector de Absorvância UV/Vis

36. Detector de Rede de Diodos (DAD)

37. 4.2. Detectores de Fluorescência • Detectam compostos com fluorescência natural (aflatoxinas) ou que se tornam fluorescentes após reação de derivação (cloreto dansyl, fluoresceína, OPA)

38. 4.3. Detectores de Índice de Refração (IR) • PRINCÍPIO: mede a mudança do índice de refração dos efluentes das colunas • IR : característica física de cada composto • IR da substância analisada  IR da fase móvel • Análise isocrática, controle temperatura • Detector universal, não seletivo e pouco sensível • Aplicações: separações preparativas, cromatografia polímeros (exclusão tamanho), açúcares, etc.

39. Detector de Índice de Refração (IR)

40. Detectores • SENSIBILIDADE • Fluorescência: 1.000 vezes mais sensível que UV-Vis • UV-Vis: 1.000 vezes mais sensível que IR • ESPECIFICIDADE • Aumenta com a sensibilidade

41. FIM !!!!!!!!!