BIOTECNOLOGIA

1. CENTRO DE CIÊNCIAS DA VIDA FACULDADE DE CIÊNCIAS BILÓGICAS BIOTECNOLOGIA “Se um dia tudo lhe parecer perdido, lembre-se de que você nasceu sem nada, e que tudo que conseguiu foi através de esforços e os esforços nunca se perdem, somente dignificam as pessoas” Charlie Chaplin Prof. Dr. José Gilberto Jardine Atualizada em agosto 2011

2. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA BIOTECNOLOGIA é resultado da intersecção entre áreas do conhecimento Bioquímica Biologia molecular Biologia Química Biotecnologia Engenharia Bioquímica Química Industria Engenharia (Engenh. Química)

3. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA 1. O QUE É BIOTECONOLOGIA? Biotecnologia é "a aplicação dos princípios científicos e da Engenharia ao processamento de materiais, através de agentes biológicos , para prover bens e assegurar serviços." CONHECIMENTO: Microbiologia, Bioquímica, Genética, Engenharia, Química, Informática. AGENTES BIOLÓGICOS: Microrganismos, Células e Moléculas (Enzimas, Anticorpos, DNA, etc.). BENS: Alimentos, Bebidas, Produtos Químicos, Energia, Produtos Farmacêuticos, Pesticidas, etc. SERVIÇOS: Purificação da água, Tratamentos de resíduos, Controle de poluição, etc.

4. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA Assim, é Biotecnologia o conjunto de técnicas que permite à Indústria Farmacêutica cultivar microrganismos para produzir os antibióticos que serão comprados na Farmácia. Como é Biotecnologia o saber que permite cultivar células de morango para obter mudas comerciais. E também é Biotecnologia o processo que permite o tratamento de despejos sanitários pela ação de microorganismos em fossas sépticas. Hoje, enquadram-se também dentro da biotecnologia as técnicas de cultivo de células e tecidos, "in vitro", visando a micropropagação, a limpeza clonal, a produção de fármacos, enzimas, hormônios, vacinas e de outros produtos químicos bioconvertidos. Além disso, há quem inclua, ainda, as técnicas de sequenciamento do DNA e as de clonagem de seres vivos, objetivando a "cópia" de indivíduos identificados como portadores de características que devem ser perpetuadas (exemplo: animais considerados excepcionais no que tange a sua capacidade produtiva - de ovos, de carne ou de leite).

5. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA 2. BIOTECNOLOGIA: PASSADO E FUTURO Já na Antigüidade o homem fazia pão e bebidas fermentadas; uma das fontes de alimentos dos Astecas eram as algas que eles cultivavam nos lagos. Por que criar uma palavra nova para uma atividade tão antiga? Porque as atividades biotecnológicas de hoje diferem muito daquelas artesanais. A partir do século XIX, com o progresso da técnica e da ciência, especialmente a Microbiologia, assistimos a grandes avanços na tecnologia das fermentações. No início do século XX desenvolveram-se as técnicas de cultura de tecidos e a partir de meados do século surgem novos horizontes com a Biologia Molecular e com a Informática que permite a automatização e o controle das plantas industriais.

6. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA No final da década de 70 a Engenharia Genética revoluciona a Biotecnologia "clássica" dando origem ao que denominamos "nova" Biotecnologia. Agora, torna-se possível "convencer " uma célula a fazer algo para o qual ela não estava programada. Esta tecnologia implica na modificação direta do genoma do organismo alvo pela introdução intencional de fragmentos de DNA exógenos (genes exógenos) que possuem uma função conhecida. Sendo assim, por meio de engenharia genética, o gene (DNA) que contém a informação para síntese de uma definida proteína de interesse pode ser transferido para outro organismo que então produzirá grandes quantidades da substância.

7. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA Estes conceitos têm definido e delimitado o que se denomina biotecnologia moderna, diferenciando-a da biotecnologia antiga. Exemplos de substâncias ou produtos que têm sido produzidos por meio da biotecnologia moderna ou engenharia genética incluem interferon humano (substância natural sintetizada no organismo humano para defesa contra vírus), insulina humana, hormônios de crescimento humano, plantas resistentes a vírus, plantas tolerantes a insetos e plantas resistentes a herbicidas. Outro uso importante da biotecnologia implica na produção de bactérias, utilizadas para biodegradação de vazamentos de óleos ou lixos tóxicos. A nova Biotecnologia já tem lançado vários produtos no mercado mundial. Em alguns casos, como os da insulina e do hormônio do crescimento, a inovação consiste em substituir os métodos de obtenção tradicionais. Em outros casos, como o dos anticorpos monoclonais, trata-se de produtos inteiramente novos.

8. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA POTENCIALIDADES A exemplo do que ocorreu com a chamada Indústria da Informação, não demorou muito para que biólogos recém-egressos das universidades criassem as primeiras Empresas de Engenharia Genética, visando a transformação de bactérias em fábricas de proteínas. Selecionaram como genes a serem introduzidos os da insulina (proteína que controla o metabolismo dos açúcares no organismo humano) e do interferon (proteína usada no combate a alguns tipos de cancer). Escolheram como hospedeiro a bactéria Escherichia coli, organismo fácil de ser mantido e multiplicado em Laboratório e que vive inofensivamente no intestino de seres humanos. Os tanques onde se cultivavam a bactéria modificada para produzir, em quantidades industriais, as proteínas acima mencionadas foram denominados de BIORREATORES.

9. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA Como era de se esperar, surgiram inúmeras idéias para produção de fármacos, enzimas, hormônios, vacinas e de outros produtos químicos bioconvertidos. Algumas Empresas, baseadas em biorreatores, funcionaram e prosperaram, enquanto que outras fracassaram. Outra área de sucesso quase que imediato foi a da aplicação das técnicas de cultura de células e tecidos vegetais, in vitro, visando a produção de "mudas" (micropropagação). Como a técnica de Engenharia Genética é "relativamente simples", ela foi quase que imediatamente aplicada, visando a produção comercial de indivíduos transgênicos.

10. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA As iniciativas mais conhecidas foram: 1. produção de uma linhagem de bactérias da espécie Pseudomonassyringae que foi geneticamente modificada para impedir a formação de gelo na superfície das plantas (combate a geada em morango); 2. produção de soja geneticamente modificada para resistir ao herbicida glifosato; 3. produção de soja, batata, algodão e milho, geneticamente modificados para resistir ao ataque de insetos (plantas com genes da bactéria Bacillusthuringiensis; daí o nome de "plantas Bt"); 4. produção de tomateiros geneticamente modificados para retardar o processo de amolecimento dos frutos e em conseqüência melhor resistir ao transporte;

11. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA 5. produção do arroz dourado: arroz geneticamente modificado que produz ß-caroteno (precursor da vitamina A) em grandes quantidade; 6. produção de milho geneticamente modificado, com grãos contendo hormônio do crescimento humano (hGH).

12. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA A Engenharia Genética, mais apropriadamente chamada de tecnologia do DNA recombinante, é um conjunto de técnicas que possibilitam a manipulação do material genético, por meio de corte e recombinação das moléculas do DNA, além de incluir processos que realizam a duplicação desse material em grande quantidade. As ferramentas fundamentais da Engenharia Genética são as enzimas de restrição ou endonucleases. São, normalmente, produzidas por bactérias, que as utilizam para fragmentar o DNA em pequenos pedaços. Os fragmentos de DNA obtidos a partir do uso das enzimas de restrição podem ser unidos por enzimas denominadas ligases.

14. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA • Nanotecnologia • É a utilização de partículas que são medidas na ordem de nanômetros em várias ciências • Nanobiotecnologia • É a aplicação da nanotecnologia na Biologia • Perspectivas: • Superfícies nanofabricadas com padrões estruturais poderiam fazer crescer artificialmente ilhas pancreáticas e reverter os efeitos da diabetes. • Nanodispositivos poderiam funcionar como kits de reparo de neurônios para pessoas com mal de Parkinson ou doença de Alzheimer. • Destruir vírus ou células cancerosas. • Descoberta acelerada de drogas, com menor custo.

16. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA A idéia que muitos leigos têm é a de que "esta nova ciência" irá fornecer as respostas para a maioria de seus problemas. Até que ponto esta concepção é correta? não estariam alguns membros da comunidade científica "vendendo uma mercadoria" que ainda não possuem no estoque? A mídia trata a Biotecnologia ora como a grande solução para os problemas atuais e futuros (visão otimista), ora como causadora de problemas, não só de "saúde", mas também de "natureza ambiental" ou até mesmo "éticos" (visão pessimista); quem estaria com a razão: os "otimistas" ou os "pessimistas"? Estas questões merecem ser discutidas de maneira mais racional, mas, infelizmente, ainda não se chegou a nenhum consenso. Na maioria das vezes, quando um grupo decide discuti-las as posições se polarizam entre os fundamentalistas da Biotecnologia versus os fundamentalistas que se opõem a ela.

17. Conceito e definição BIOTECNOLOGIA Fazendo uma analogia com a CONSTRUÇÃO DE UM PRÉDIO, diria que o Edifício da Biotecnologia ainda está em construção: poucos de seus apartamentos já estão prontos e podem ser habitados, outros necessitam finalizar o acabamento e, finalmente, existem aqueles que ainda estão sem portas, janelas e até sem paredes externas. A insistência em habitar estes últimos resulta, muitas vezes, em acidentes graves, que podem, inclusive, redundar em morte do condômino.

18. BIOTECNOLOGIA BIOPROCESSOS CATALISADOS POR ENZIMAS

19. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3. BIOPROCESSOS CATALISADOS POR ENZIMAS • ENZIMA é uma proteína sintetizada na célula viva que catalisa uma reação termodinamicamente possível. • As enzimas são de ocorrência universal nos materiais biológicos. • Grande crescimento nos últimos anos devido sua importância nas áreas : farmacologia, tecnologia de alimentos, toxicologia, medicina, engenharia química, biotecnologia, etc. • As enzimas são hidrossolúveis. • A enzima não modifica a constante de equilíbrio de uma reação pois atua em concentrações muito baixas que não guardam proporção com a mudança catalisada. • Natureza de especificidade. • Origens: Humana : pepsina (estômago), amilases (saliva), proteases, amilases, lipases ( pâncreas ) renina ( estômago de ruminantes); • Vegetal : papaina ( mamão ), bromelina ( abacaxi ), ficina ( figo ); • Microbianas ( bactérias, leveduras, fungos ). • Presença indesejável : escurecimento de vegetais; clarificação; rancificação, etc.

20. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.1 Cinética enzimática • Do ponto de vista termodinâmico, uma enzima é um catalisador que acelera uma reação porque diminui a energia de ativação. Isto acontece porque a enzima aumenta o número de moléculas ativas, capazes de reagir. Ane Coordenadas de energia Ea para reação não enzimática Ae Ea para reação enzimática dF de reação Coordenadas de reação

21. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • Influência da Concentração de Enzima, Concentração de Substrato,Temperatura, pH, na cinética de reações catalisadas por enzimas. (rever bioquímica) • 3.2 Extremozimas • Há cerca de 30 anos, os cientistas pensavam que só existia vida em um número muito limitado de habitats. Hoje, porém, não resta dúvida de que até mesmo os ambientes mais extremos são colonizados por microorganismos especiais, muito bem adaptados a esses “ninhos” ecológicos. Esses organismos, os extremófilos, estão presentes em biótipos onde outras criaturas não conseguem sobreviver. • Os extremófilos são encontrados em altas temperaturas (termófilos), sob condições de frio extremo, como geleiras (organismos psicrofílicos), em lagos de elevada salinidade (halófilos) e em ambientes extremamente ácidos (acidófilos) ou alcalinos (alcalinófilos), nas altas pressões do fundo do mar ou na abundância de metais tóxicos (metalófilos) • A descoberta de organismos extremófilos abre novas oportunidades para o desenvolvimento de enzimas que apresentam atividade sob as circunstâncias extremas (as extremozimas), encontradas com freqüência em processos industriais.

22. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.3 Classificação das enzimas • OXIDO-REDUTASES : catalisam as reações de óxido-redução. Os nomes comuns para muitas dessa enzimas são: desidrogenases, oxidases, peroxidades. • HIDROLASES : catalisam as reações de hidrólise. Há um grande número dessas enzimas. • TRANSFERASES : catalisam a transferência de grupos. Alguns nomes comuns: transaminases quinases, transacetilases. • ISOMERASES : catalisam diferentes tipos de isomerisação. São divididas em: racemases, epimerases, cis-trans isomerase, cetol isomerases intramoleculares, mutases ou transferases intramoleculares. • LIGASES : catalisam reações que unem duas moléculas conjugadamente com o rompimento de uma ligação pirofosfórica. • LIASES : catalisam reversivelmente a remoção de grupos do substrato não hidroliticamente. A fumarase catalisa a remoção de água de malato de modo reversível dando fumarato.

23. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.4Hidrolases/Carbohidrases • Alfa amilase: É uma endoenzima que catalisa as reações de hidrólise das ligações glicosídicas α-(1-4) do amido internamente, de forma desordenada. O produto da hidrólise são oligossacarídeos de médio P.M. (dextrinas). Origem das α-amilases: suco pancreático, saliva; durante germinação de cereais; fúngica ou bacteriana. • Beta amilase: É uma exoenzima que catalisa a reação de hidrólise das ligações glicosídicas α-(1-4) de duas em duas unidades de glicose a partir da extremidade não redutora das moléculas do amido. Os produtos da hidrólise são maltose e beta limite dextrina. • Origem das beta amilases: cereais como a cevada, soja, batata doce; microbiana – bactérias. A batata doce crua tem gosto de amido. Após cozimento tem sabor adocicado. Porque? Malteação da cevada para fabricação de cerveja e wisk.

24. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • Amiloglicosidase: É uma exoenzima que catalisa a reação de hidrólise das ligações glicosídicas α-(1-4) e α-(1-6) de uma em uma unidade de glicose a partir da extremidade não redutora. • O produto da hidrólise é a glicose. • Desramificantes: É uma endoenzima que catalisa a reação de hidrólise das ligações glicosídicas α-(1-6). Transforma amilopectina em amilose. • Ciclodextrina-glicosil-transferase ( CGTase): catalisa as reações de hidrólise das ligações glicosídicas α-(1-4) e em seguida catalisa a ciclização do oligossacarídeo. O produto são ciclodextrinas formadas principalmente por seis unidades de glicose (α-ciclodextrina); sete unidades de glicose (β-ciclodextrinas) e oito unidades de glicose (-ciclodextrinas), podendo chegar a até 12 unidades. • As ciclodextrinas possuem uma superfície exterior polar e uma cavidade apolar. Dado o caráter hidrófilo da superfície exterior, as ciclodextrinas podem dissolver-se na água, ao mesmo tempo que disponibilizam uma cavidade apolar (hidrófoba) capaz de formar complexos de inclusão com vários tipos de moléculas hóspedes.

25. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • Dextram sacarase: Catalisa a reação de hidrólise da sacarose e em seguida catalisa a polimerização das unidades de glicose através de ligações glicosídicas α-(1-6) e α-(1-3). O polímero que se forma é denominado de Dextrano. • O dextrano reduz o rendimento industrial de sacarose porque: aumenta a viscosidade do caldo dificultando a clarificação deste; reduz a velocidade de cristalização da sacarose; causa entupimento dos filtros; perda de sacarose que se transforma em dextrano. Na indústria farmacêutica essa enzima é empregada justamente para se obter o dextrano utilizado como substituto do plasma sanguíneo. Nas indústrias química e de alimentos o dextrano é utilizado como espessante em processos tecnológicos. • Invertase: Catalisa a reação de hidrólise da sacarose produzindo açúcar invertido – glicose mais frutose. Glicose 70% da doçura da sacarose Frutose 50% mais doce que a sacarose

26. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • β-galactosidase ou lactase: Catalisa as reações de hidrólise das ligações glicosídicas β-(1-4) dos oligossacarídeos que possuem a galactose na estrutura molecular. Os seres humanos sintetizam essa enzima, principalmente na infância quando o consumo de lactose é maior. A falta de lactase no organismo causa flatulência e diarreia pois a lactose não pode ser hidrolisada e absorvida no trato digestivo, sendo fermentada por microorganismos. (Lactose é um dissacarídeo formado por galactose e glicose unidas por ligações glicosídicas β-(1-4).

27. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.5 Processo de produção de dextrinas ( Liquefação do amido) • A liquefação do amido consiste na obtenção de suspensões com alta concentração de oligossacarídeos de pesos moleculares variados. • Liquefação ácida • Liquefação enzimática • 3.6 Processo de produção de glicose, frutose..... • 3.7 Hidrolases/Pectinases • Substâncias pecticas: são polímeros do ácido D-galacturônico unidos por ligações glicosídicas α-(1-4) e se constituem basicamente em protopectinas, ácido pécticos, ácido péctinicos e pectinas. • Pectina: polímero de ácido galacturônico interligados por ligações glicosídicas α-(1-4), metoxilados em diversos graus (baixo médio e alto). Formam soluções altamente viscosas mesmo em baixas concentrações. Formam géis com sacarose e ácidos. Pectinas naturais possuem cerca de 50% dos grupos carboxilas metoxilados

28. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • Pectina metil esteraze: catalisa a remoção de grupos metoxila esterificados nas substâncias pécticas. • Polimetil galacturanase: catalisa a hidrólise das ligações glicosídicas dos ácidos galacturônicos metoxilados. A forma endo catalisa a hidrólise de forma desordenada enquanto que a forma exo remove unidades a partir das extremidades. • 3.8 Aplicações das pectinases • Extração • Clarificação

29. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.9 Hidrolases/Proteases • Proteases ou enzimas proteolíticas: catalisam reações de hidrólise das ligações peptídicas das proteínas. • Exopeptidases; catalisam as reações de hidrólise dos aminoácidos das extremidades das cadeias protêicas. São encontradas as carboxipeptidases e as aminopeptidases • Endopeptidases: catalisam as reações de hidrólise das ligações peptidicas internas às moléculas de proteínas. São encontradas as: • Serina protease: no centro ativo da enzima há uma serina. • SH protease: centro ativo contem grupo sulfidrila. • Metalo protease: centro ativo contem metais - Mg, Zn, Co, Fe, Cu, Ni, Cd. • Protease ácida: possui pH ótimo de atividade em torno de 2 a 5. Em geral, seu centro ativo possui grupo carboxila.

30. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.10 Aplicações de proteases • 3.11 Hidrolases/Lipases • Lipases ou enzimas lipolíticas: catalisam reações de hidrólise de lipídeos a glicerol, mono ou diglicerídeos. São encontradas no pâncreas, plasma sangüíneo, saliva, suco pancreático, leite e plantas oleaginosas. Há vários microorganismos produtores de lipases, fungos leveduras e bactérias. • Tecnologicamente é muito importante não apenas a função catalítica de hidrólise mas também as funções catalíticas em reverso em reações de transesterificação e de esterificação, dependendo das condições de reação.

31. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.12 Oxiredutases • São enzimas que catalisam reações de oxidação e de redução. • Dehidrogenases: catalisam reações de oxidação provocando a eliminação de hidrogênio do substrato. • Oxigenases: catalisam reações de oxidação, incorporando oxigênio molecular ao substrato pela ativação do oxigênio. • Peroxidases: utilizam o peróxido de hidrogênio como oxidante para provocar a oxidação do substrato. • Fenolases: catalisam a oxidação de compostos fenólicos. Principal enzima é a polifenoloxidase. • Catalase: catalisa especificamente a decomposição da água oxigenada em oxigênio molecular e água. • Lipoxigenase: encontrada apenas em vegetais, particularmente em leguminosas. Catalisam reações de degradação e oxidação de ácidos graxos insaturados, dando origem ao ranço lipolítco-enzimático. Os radicais livres originários da degradação dos ácidos graxos, destroem proteínas e vitaminas.

32. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • Ácido ascórbico oxidase: catalisa a reação de oxidação do ácido L-ascórbico a L-dehidroascórbico. A reação pode ser revertida utilizando-se a enzima ácido ascórbico redutase. • 3.13 Isomerases • Catalisam diferentes tipos de isomerisação. São divididas em: racemases, epimerases, cis-trans isomerase, cetol isomerases intramoleculares, mutases ou transferases intramoleculares. • Glicose isomerase: catalisa a interconversão entre aldose e cetose. • Glicose Frutose

33. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.14 Outras Aplicações de Biocatalisadores • Álcool Etílico • No Brasil o álcool combustível é produzido facilmente a partir de cana de açúcar, um substrato diretamente fermentável que dispensa pré-tratamento e hidrólise. • O álcool combustível pode se obtido a partir de amido de milho, sendo um dos grandes objetivos da biotecnologia americana e de muitos países europeus a viabilização econômica do álcool de materiais lignocelulósicos e principalmente de resíduos da agroindústria. • A produção de etanol de mandioca e de resíduos da agroindústria, chamados de biomassa, envolve a hidrólise destes materiais à açúcares fermentáveis. • Ração animal • As enzimas para ração animal, adicionadas à ração de suínos e aves domésticas, destinam-se a reduzir a excreção de produtos residuais e melhorar a digestibilidade de matérias-primas. • As xilanases e as fitases encontram-se entre as enzimas de ração animal mais conhecidas, sendo ambas produzidas por meio de microorganismos modificados pela engenharia genética.

34. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA A xilanase hidrolisa as hemiceluloses presentes no trigo e no milho, facilitando a digestão de todos os nutrientes e reduzindo a excreção de estrume, nitrogênio e fósforo. A fitase decompõe o fitato, composto fosforoso presente nos grãos de ração animal. Os animais requerem fosfatos para seu adequado crescimento esquelético, mas não são capazes de digerir o fitato. Costuma-se, portanto, acrescentar fósforo (inorgânico) à ração, o que leva à excreção de grandes volumes de fósforo e à poluição do meio ambiente. O fitato pode ser digerido pela adição de fitase à ração animal. Reduz-se assim a necessidade de usar suplementos de fosfato inorgânico com vantagens econômicas e ambientais.

35. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • Alimentos Cerveja Clarificação de cerveja Malteação Sucos de Frutas Extração Clarificação Vinhos Extração Panificação Proteases Amilases

36. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • Carnes • Amaciamento • Leite • Deslactação • Sorvete/Doce de leite • Papel • Couros • Tecelagem • Detergentes • Medicamentos

37. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • 3.15 Reatores com células ou enzimas Imobilizadas • Os sistemas com agentes imobilizados têm como principal característica o uso de algumas estruturas físicas de confinamento que obrigas os agentes do bioprocesso a permanecerem em uma região particular do biorreator. • A opção entre as formas solúvel e imobilizada de uso de uma enzima ou célula depende da natureza do processo de conversão e da estabilidade operacional das duas formas. • No caso das células imobilizadas há que considerar dois tipos de bioprocessos. • O primeiro é aquele que utiliza uma ou algumas enzimas contidas nas célula, não havendo necessidade de coenzimas e vias anabólicas presentes na replicação celular. As células não necessitam estar vivas quando imobilizadas; somente deve estar ativo o sistema enzimático envolvido na conversão bioquímica requerida. • O segundo tipo de processo que utiliza células imobilizada é aquele em que se impõe a necessidade de manter a viabilidade celular, uma vez que os produtos a serem formados requerem múltiplos passos de transformações, regeneração de coenzimas, presença de cadeia respiratória, vias metabólicas geradoras de intermediários e outros mecanismos inerentes às células vivas.

38. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA As principais vantagens da utilização de agentes biotecnológicos imobilizados são: - possibilidade de utilização de altas concentrações do agente no volume reacional, implicando em maiores velocidades de processamento; - operação de sistemas contínuos à vazão específica de alimentação; - maior proteção ao sistema biológico em relação ao estresse ambiental, ocasionado por elevadas concentrações de substrato, pH e cisalhamento; - reuso do agente de bioprocesso; - redução do investimento fixo nas instalações; - redução do custo operacional. Processos que utilizam células imobilizadas Produção de ácido acético (vinagre) Produção de etanol Produção de antibióticos Tratamento de resíduos Produção de metabólitos utilizando células animais ou vegetais

39. Bioprocessos/Enzimas BIOTECNOLOGIA • Métodos de Imobilização de biocatalisadores Enzimas Imobilizadas Ligação a suporte * Entrelaçamento Adsorsão física Ligação iônica Ligação covalente matrizes microcápsula * Com ligação cruzada ou não

40. BIOTECNOLOGIA BIOPROCESSOS CONDUZIDOS COM MICRORGANISMOS

41. MICRORGANISMOS Vírus Bactérias Fungos Algas Protozoários Substrato Adicionados no meio de cultura Recuperação e Purificação do Produto Produtos do metabolismo Célula microbianas Fração das células RESIDUO OU MATERIAL DE EXCREÇÃO As características essenciais de um bioprocesso microbiológico industriais + +

42. Esquema geral de um bioprocesso Microrganismo selecionado Preparo inoculo: etapa de laboratório Preparo inoculo: etapa industrial Meio de cultura selecionado Matérias-primas Esterilização Células Separação das células Biorreator Caldo fermentado Ar Recuperação Produto Esterilização do ar Compressor Produto Tratamento efluentes

43. BIORREMEDIAÇÃO • Tecnologia que utiliza agentes biológicos, particularmente os microrganismos, para remover poluentes tóxicos do ambiente, principalmente do solo e da água. Os poluentes são decompostos em substancias atóxicas por meio do metabolismos microbiano.

44. Bioprocessos/Microrganismos BIOTECNOLOGIA • 4. BIOPROCESSOS COM MICROORGANISMOS • 4.1 Substrato • Uma grande variedade de matérias-primas, geralmente provenientes da agroindústria, são utilizadas como fonte(s) de substrato(s) e outros nutrientes. De uma forma geral, as matérias-primas de bioconversões podem ser agrupadas em função da estrutura e da complexidade molecular dos substratos. • A matéria-prima é um dos componentes mais relevantes nos custos de produção, havendo casos em que pode representar até 75% do custo total, sendo esta uma das razões pelo crescente interesse no aproveitamento de resíduos agroindustriais. • A escolha dos nutrientes adequados à geração do produto de interesse está relacionada à atividade metabólica desenvolvida pelos microrganismos. Nesse ponto, destaca-se a importância das informações obtidas sobre as exigências nutricionais da população microbiana envolvida no processo.

45. Bioprocessos/Microrganismos BIOTECNOLOGIA • As condições que permitem a produção máxima de massa molecular não são necessariamente as mesmas que permitem a máxima produção de um determinado produto. Aspergillus niger , por exemplo , dá melhores rendimentos de ácido cítrico, quando seu crescimento é restringido , por concentrações de semi-inanição de nitrogênio, fósforo, porem com alta concentração de açúcar. • Agrupamento das fontes de substrato em função da estrutura e da complexidade molecular dos substratos. • Substratos solúveis que podem ser facilmente extraídos produto(s) como por exemplo, sacarose, glicose, frutose e lactose, provenientes de cana-de-açúcar, beterraba, melaço, soro de leite, etc. • Substratos insolúveis, que precisam de tratamento moderado para solubilização e hidrólise, antes da conversão em produto(s) como por exemplo, amido de milho, mandioca, trigo, cevada, batata, etc. • Substratos insolúveis muito resistentes, que necessitam de pré-tratamento físico, seguido de hidrólise química ou enzimática para produzir substratos na forma monomérica a ser convertidos em produto(s) como, por exemplo, celulose e hemicelulose.

46. Bioprocessos/Microrganismos BIOTECNOLOGIA 4.1.1 Fonte de energia: A adenosina-trifosfato (ATP) é o composto mais importante nas transformações de energia das células. As bactérias e as algas fotossintéticas podem utilizar a energia da luz para formação de ATP; as bactérias autotróficas podem gerar ATP pela oxidação de compostos inorgânicos; ao passo que as bactérias, leveduras e fungos heterotróficos formam ATP oxidando compostos orgânicos. Nas indústrias de fermentação, a fonte mais comum de energia é amido ou melaço. 4.1.2 Fonte de carbono: As necessidades de carbono são supridas com a fonte de energia, porém as bactérias autotróficas e fotossintéticas utilizam dióxido de carbono. A via pela qual os heterotróficos metabolizam carbono de substrato é importante para se determinar a quantidade de carbono convertido em material celular. Verifica-se que os organismos facultativos incorporam cerca de 10% do carbono do substrato quando metabolizam anaerobiamente, porém 50 - 55% com metabolismo completamente aeróbio. 4.1.3 Fonte de nitrogênio: O nitrogênio pode ser suprido à maioria dos organismos industrialmente importantes por meio de amônia ou de seus sais, embora o crescimento seja mais rápido quando se utiliza nitrogênio orgânico. Os compostos orgânicos nitrogenados mais utilizados industrialmente são: farelo de soja, farelo de amendoim, farinhas de peixe ou carne, as borras de cerveja, extrato de levedura, soro de leite. 4.1.4 Fonte de minerais: fósforo e magnésio são constituintes particularmente importantes no meio de cultura, pois são relacionados com todas as reações de transferência de energia envolvendo ATP. Também são indispensáveis para o bom desenvolvimento da cultura, o cálcio, potássio, enxofre e sódio, assim como os micronutrientes: ferro, cobalto, cobre e zinco.

47. Bioprocessos/Microrganismos BIOTECNOLOGIA • 4.2 Esterilização de equipamentos e substrato • Esterilização é o processo físico ou químico que destrói ou inativa todas as formas de vida presentes em um determinado material, especialmente microrganismos incluindo bactérias, fungos - tanto em suas formas vegetativas como esporuladas - e viros. O termo esterilização possui um significado absoluto e não relativo, ou seja, uma substância ou material não pode ser parcialmente estéril. Um material estéril é totalmente isento de qualquer organismo ativo. • Em alguns processos biotecnológicos industriais, a eliminação parcial da população microbiana dos equipamentos e meios de crescimento é suficiente para garantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde inibidores de crescimento são produzidos (fermentação alcoólica, produção de vinagre, ácido láctico, antibióticos e outro biocidas), o teor de inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vários microorganismos. • Existem, também, bioprocessos em que se prescinde totalmente de assepsia, como é o caso dos biotratamentos, nos quais a microbiota nativa, atuando de forma consorciada é extremamente desejável, para que haja redução da carga orgânica poluidora. • Na prática, considera-se que uma esterilização foi realizada com sucesso quando estiver garantida a assepsia adequada.

48. Bioprocessos/Microrganismos BIOTECNOLOGIA A esterilização pode ser pela destruição ou pela retirada dos microrganismos do meio A destruição é feita pela aplicação de calor , produtos químicos ou radiação . A retirada é feita por processo de filtração . 4.2.1 Calor: De todos os processos empregados para a destruição de microrganismo, o calor é, sem dúvida, o mais eficiente e econômico. Pode ser empregado de duas maneiras: seco ou úmido. Calor secoage promovendo uma oxidação violenta de compostos do protoplasma. Sua eficiência é relativamente baixa, pois tem pouca capacidade de penetração. Nem todo tipo de material pode ser submetido às temperaturas necessárias para esterilização pelo calor seco (160 a 180 oC) durante um tempo mínimo de uma ou duas horas. Calor úmido é muito mais eficiente. Age promovendo a destruição de proteínas e dissolução de lipídeos. Tem alta capacidade de penetração e pode ser utilizado para uma grande variedade de materiais . A forma mais comum de emprego do calor úmido consiste na utilização de vapor de água superaquecido sob pressão. A esterilização com calor pode ser descontínua (batelada) ou contínua.

49. Bioprocessos/Microrganismos BIOTECNOLOGIA • Na esterilização em batelada, o tempo total de esterilização é relativamente grande, podendo dar origem a decomposição de nutrientes termo-sensíveis, como vitaminas, ou provocar reações indesejáveis entre os constituintes do meio, como, por exemplo, reações entre aminoácidos e açúcares redutores (reação de Maillard). Esta modalidade de esterilização vem sendo substituída, sempre que possível, pela esterilização contínua, na qual se preserva mais a integridade dos constituintes do meio, já que o aquecimento e o resfriamento são praticamente instantâneos. Obviamente, a esterilização contínua é essencial para sistemas contínuos de fermentação. • Esterilização em batelada , com vapor (descontínua)- Todo conteúdo do biorreator • é esterilizado em uma só operação . Pode ser de duas maneiras : • - em uma autoclave • . Aquecimento da água contida na autoclave • . Injeção de vapor • - no próprio biorreator • . Circulação de vapor • . Injeção direta de vapor

50. Bioprocessos/Microrganismos BIOTECNOLOGIA Esterilização em batelada , com vapor (descontínua) 120 100 Temperatura 50 Tempo aquecimento esterilização resfriamento