1. 实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel

2. 一．实验目的及背景 • 在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列， 分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开， 这就需要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ， 以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等.

3. 从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法 现在常用的技术有： • 电洗脱法 • 低熔点琼脂糖凝胶法 • ＤＥＡＥ滤膜插片法等 • 其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对ＤＮＡ的回收效果好。

4. 低熔点琼脂糖凝胶法 • 65oC琼脂糖凝胶熔点 • 低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体

5. ＤＥＡＥ滤膜插片法 • High efficient • DNA high quality for microinjection • <5kb fragment • 100ng DNA fragment • 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes • 0.5 mol/L NaOH 5 minutes • 低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0) • 高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)

6. 电洗脱法基本原理 • 将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。 • 取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、氯仿抽提纯化。

7. 二．实验试剂及仪器 • NaHCO3 2% • EDTA-Na2 0.01M • TBE电泳液 10.8g Tris碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml 琼脂糖 透析袋ＴＥ 酚 氯仿 乙醇

8. 三、实验方法 • 一、透析袋的处理： • １．切取适当长度适析袋。 • ２．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸１０分钟。 • ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。

9. 二、电洗脱 • １．在长波紫外灯下（３００－３６０nm ）将含目标ＤＮＡ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。 • ２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。 • ３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。 • ４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全部移出凝胶。 • ５．改变电场方向继续通电１分钟。 • ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ml Eppendorf管中。

10. ７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去ＥＢ。７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去ＥＢ。 • ８．在台式离心机上最高速２分钟。 • ９．吸去上层，正丁醇溶液。 • １０．重复７，８，９二次。 • １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚氯仿（２个）抽提２次。 • １２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于２０℃过夜。

11. １３．12000g，4℃下离心１０分钟，得ＤＮＡ沉淀。１３．12000g，4℃下离心１０分钟，得ＤＮＡ沉淀。 • １４．弃上清，加入７０％乙醇洗涤２次后弃干乙醇。 • １５．加入５０μl ＴＥ溶解ＤＮＡ。 • １６．取１０μl ＤＮＡ溶液加入2μl Loading buffer于０．８％琼脂糖上， ４０伏电泳，３小时。 • １７．在紫外透射仪上观察结果。 • １８．测定ＤＮＡ溶液OD260,OD280值。

12. 结果与分析 • １．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯度。 • ２．记录电泳结果 • 问题与讨论： • １．电洗脱过程后，为什么要反向电泳１分钟？ • ２．电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？

13. 玻璃奶法快速纯化回收DNA片段 本方法有多种用途，主要包括： • 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； • 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段； • 从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）； • DNA浓缩、去盐及去除杂质。 • 本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀作用的白色颗粒，能专一性结合0.2kb到50kb大小的DNA（双链或单链，线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。

14. 使用本法回收DNA片段有以下优点： • 高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等； • 简便：所需主要仪器是一架台式离心机； • 快速：整个回收过程只需半个小时； • 高效：回收得率达到70%以上； • 多用途：可以同时作胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等； • 安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。

15. 二、试剂盒组成 • 1．碘化钠溶液： 50ml • 2．DNA洗涤液（20倍浓缩液）：10ml • 3．“基因纯”试剂： 1ml • 4．超纯水： 1ml • 使用前，将DNA洗涤浓缩液（10ml）倒入一玻璃瓶中，加140ml无水乙醇及50ml蒸馏水（由使用者自配），混匀后置于-20℃冰箱中，其余溶液置于4℃冰箱。

16. 三、操作步骤 • 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段 • a. 常规DNA电泳。按常规方法用溴化乙锭（EB）染色DNA，而后将欲分离的DNA带从胶上切割下来，置于一1.5ml离心管中。 • b. 称出凝胶带的重量，加入三倍量（V/W）的碘化钠溶液。（如0.1g凝胶中加入0.3ml碘化钠溶液）。 • c. 置于55℃水浴5-10分钟，直至凝胶完全溶化。 • d. 加入20ul充分混匀的“基因纯”试剂（建议使用前用漩涡振荡器振荡3分钟），室温放置5分钟（期间不时将管子颠倒几次以混匀）。

17. e. 离心10秒（10,000rpm），倒去上清液。 • f. 加0.8ml刚从冰箱中取出的DNA洗涤液，充分摇匀，离心10秒，去上清。 • g. 重复步骤f两次（共洗涤三次）。 • h. 用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。 • i. 加入20ul超纯水，混匀后置于55℃水浴5分钟。 • j. 离心3分钟，将上清液小心吸至另一个离心管，即为纯化的DNA。可直接用于酶切、亚克隆、PCR、标记、探针制备、序列测定、细胞转染等。

18. 注意事项： • 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 • DNA洗涤液应保持在低温，否则可能使DNA从“基因纯”试剂上脱落而导致回收率降低。 • 步骤h是另一关键，管壁和管底残留的洗涤液若不完全除去，可能导致“基因纯”试剂上结合的DNA无法由蒸馏水洗脱。

19. PCR反应物中纯化目的DNA片段 • PCR反应完毕后，加蒸馏水至100ul（最后体积）。 • 加入300ul碘化钠溶液，混匀。 • 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。

20. 从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的DNA片段从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的DNA片段 • 探针制备反应完毕后，加蒸馏水至100ul（最后体积）。 • 加入300ul碘化钠溶液，混匀。 • 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。

21. DNA浓缩，去盐及去除杂质 • 加入3倍量的碘化钠溶液于样品DNA溶液中（若DNA为固态，则先将之溶于适量水或TE中，再加3倍体积的碘化钠溶液）。 • 加20ul或更多的“基因纯”试剂（每ul该试剂可吸附0.3ugDNA，操作者可根据这一指标自行决定“基因纯”试剂的用量，但不应少于10ul）。 • 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。