SEROLOJİ: KAN VE VÜCUT SIVILARININ ANALİZİ

1. SEROLOJİ: KAN VE VÜCUT SIVILARININ ANALİZİ HAZIRLAYANLAR: NUR KILINÇ H.İMRAN GÜNGÖRDÜ

2. SEROLOJİ NEDİR? • Seroloji (serum bilimi); serum imali veya tesirlerini konu alan bilim dalıdır. Bir disiplin olan seroloji, serumları incelemeye yönelik birçok tekniği içinde barındırır.

3. Adli seroloji ise bir suçun aydınlatılması için vücut sıvısı veya dokusuna immünolojik veya biyokimyasal metotların uygulanmasıdır.

4. Serolojide incelenen vücut sıvıları: • Kan • Semen • Tükürük • İdrar • Gözyaşı ve göz içi sıvısı • Gaita • Mide özsuyu • Lenf sıvısı ve diğer tüm vücut sıvıları

5. Delillerin Toplanması: • Lekenin kuru veya sıvı halde olmasına, üzerinde bulunduğu materyalin özelliğine ve büyüklüğüne uygun malzeme ve yöntemle deliller alınır. Tükürük genellikle ısırık izleri ile birlikte bulunur.

6. Islak tükürük veya diğer vücut sıvılarını içeren giysilerin dışına ve içine kağıt katmanları konulmalı kuru yerinden tutulup kağıt taşıyıcıya yerleştirildikten sonra ikinci bir kağıt taşıyıcıya konulmalıdır. • Sigara izmariti, yiyecek artıkları, peçete, kürdan gibi tükrük örneği taşıyabilecek materyaller el değmeden, pensle alınmalı ve her örnek ayrı taşıyıcıya konulmalıdır

7. Biyolojik Sıvıların Belirlenmesi • Suç laboratuarlarına gelen örnekler genellikle kuru ve aşınmış şekilde gelir. Bu durum bazen araştırmacıya yardımcı olurken bazen de engel olur. Örneğin sıvı kandaki işaretler kurumuş kandakine oranla çok fazladır. Bu durum araştırmacının işini zorlaştırır. Örnek kuruma aşamasındayken içerdiği genetik işaretler korunur. Adli serolojist bu sayede lekeyi tanımlar, sınıflandırır ve bireyselleştirir.

8. Biyolojik Sıvıların Belirlenmesi • Görsel, mikroskobik ve kimyasal olarak üçe ayrılır. • Birçok leke bazı metotlarla görülebilir hale getirilebilir. Örneğin UV ışığı tutularak veya lazer ışık kaynakları kullanılarak yapılabilir. Semen lekesi bu metotlarla belirlenebilir. Kan lekesi için görsel ve mikroskobik yöntemler uygulanır.

9. Lekeleri belirleme işlemi iki aşamadan oluşur. - İlk aşama ihtimalî (presumptive) - İkinci aşama teyit edici (katî) (confirmatory). • Presumptive testleri delilleri elemek amacıyla yapılırken confirmatory testleri işlemi doğrulamak amacıyla yapılır.

10. KAN • Kan organizmada kapalı kanallar sistemi içinde dolaşan bir dokudur.Dolaşım kanı, plazma adı verilen sıvı bir ortam içinde süspansiyon halinde bulunan şekilli elemanlardan meydana gelmiştir.

11. Kan; olaylar hakkında aydınlatıcı ve güvenilir bilgiler vermesi bakımından serolojide çok önemli bir kanıttır. • Olayların çözülmesinde çok büyük katkısı vardır.

12. Damardan bir santrifüj tüpüne alınan kan kendi haline bırakılırsa içerdiği şekilli elemanlar pıhtılaşma faktörleriyle birlikte çökerek ayrılırlar ve pıhtı oluşur. Pıhtının üzerindeki sıvı kısım ise serumdur.

13. Kan Lekesinin Belirlenmesi • Bir kan suç delili olarak alındığı zaman gerçekten kan olup olmadığı Kastle-Meyer testi ile belirlenebilmektedir. Bu teste göre kan izi üzerine fenolftalein püskürtüldüğünde birkaç dakika içinde rengi pembeye dönmektedir. Precipitin testi ile bir kan örneğinin hayvana mı yoksa insana mı ait olduğu belirlenebilmektedir.

14. Kan lekesi için görsel ve mikroskobik yöntemler uygulanır. Önce kan lekesi olması muhtemel bölgelere bakılır. Örneğin suçlu işini bitirdikten sonra ellerini cebine sokmuş olabilir bu yüzden ceplerin içinde kan lekesi aranır. Kan lekesinin rengi parlak kırmızıdan koyu yeşile kadar değişir.

15. Kanın belirlenmesinde kullanılan metotlar üç sınıfa ayrılmıştır: Kristal testleri (teyit edici) Katalitik testler (ihtimalî) Enstrümantal metotlar

16. 1. Kristal Testleri Haemin, haematin, haemochromogen gibi hemoglobin türevi kristallerin biçimlenmesiyle oluşurlar. En çok bilinen kristal testi Takayama testidir.

17. 2. Katalitik Testler Hemoglobinin hem grubu peroksidaz gibi aktiviteye sahiptir. Bu özelliği hidrojen peroksitin bozulmasını katalizler. Oksitlenmiş türler ortamdaki çeşitli substratlarla reaksiyona girerek görünür renk değişikliği gösterirler. Kullanılan substratlar benzidin ve çeşitli substütiye benzidinler, orto-tolidine, leucomalachite yeşili, leucocrystal viyolesi ve fenolftaleindir (Kastle-Meyer).

19. Kastle-Meyer Reaksiyonu

20. Görünmeyen kan lekelerini belirlemede ise genellikle luminol kullanılır. Yıkanmış veya silinmiş kan lekelerini de belirleyebilir. Luminol spray haline getirilip uygulandığında eğer kan varsa 45 saniye içinde mavimsi ışık yayılır.

21. Luminol – Kan Reaksiyonu

23. 3. Enstrumental Metotlar • HPLC kandaki hemoglobinin absorbansını ölçerek hemoglobin varlığını doğrular. Bu metotla cenine ait hemoglobin ile yetişkine ait hemoglobin birbirinden ayırt edilebilir. Ayrıca analiz edilen kanın yaşı hakkında tahminen bilgi verir.

24. SEMEN • İçinde sperm bulunan seminal sıvıya semen denir. Seminal sıvı içinde hücreler,enzimler, oranik ve inorganik maddeler bulundurur.

25. Genital sıvılar içinde özellikle semen cinsel taciz olaylarını aydınlatmada çok kullanılan bir vücut sıvısıdır.

26. Semen lekesinin belirlenmesi: Semen lekeleri; kıyafetlerde, vücutta, çarşaflarda karakteristik dokusu ve rengi sayesinde görsel olarak belirlenebilir. Semen süt beyazı rengindedir. Alternatif olarak UV ışını altında bakılarak da belirlenebilir çünkü floresans özellik gösteren bir maddedir. Semen lekeleri birkaç farklı metotla analiz edilir. Birincil teknik; numunedeki sperm hücrelerini gözlemlemektir. Bu mikroskobik test ikna edicidir. Eğer sperm hücreleri gözlemlenemezse semeni diğer maddelerden ayırabilmek için farklı metotlardan faydalanılır. Diğer testler semene özgü maddelerin belirlenmesi ve seminal sıvının varlığının doğrulanması için kullanılır.

27. UV Işını (Woods Lamp Technique) • Semenin içeriğindeki Protein olmayan maddeler ve Pseudomonas fluorescensbakterileri nedeniyle UV ışığı altında görüntü rengi farklılık gösterebilir (mavimsi beyaz vs.)

28. Semen için olası (presumptive) testler: • Seminal Asit Fosfataz (SAP) Asit fosfatazlar canlı dokularda bulunan bir grup enzime verilen addır. Semen de yüksek miktarda asit fosfataz içerir. SAP enzimleri prostat bezindeki epitel hücreleri tarafından salgılanır.

29. SAP için Brentamine Fast Blue Testi Sodyum-α-naftil fosfatın asit fosfataz tarafından bozunması sonucu o-dianisidinin (Fast Blue B) renkli bileşenine dönüşmesiyle reaksiyon gerçekleşir.

30. Metot : • Substrat (sodyum-α-naftil fosfat) • Kromojen (o-dianisidin) • Seminal asitfosfataz (semende) • SAP substrat ile reaksiyon verir ve renk değişimi olur.

31. SAP testi için nemli svap veya filtre kağıdı lekenin üzerine sürülerek örnek alınır.Üzerine reaktif substratı damlatılır. Mor renk gözlenirse sonuç pozitiftir.Ancak kesin semen varlığını göstermez.

32. Yeni oluşmuş lekeler kuvvetli reaksiyon verirken eskimiş lekeler zayıf reaksiyon verir. Diğer vücut sıvılarıyla (ter, vajinal salgılar, idrar) karışmış semen de zayıf reaksiyon verir.

33. Birçok leke bazı metotlarla görülebilir hale getirilebilir. Örneğin UV ışığı tutularak veya lazer ışık kaynakları kullanılarak yapılabilir. Semen lekesi bu metotlarla belirlenebilir.

34. Semen için Teyit edici (confirmatory) testler: 1. Çam ağacı şeklinde semen lekesi : Lekenin mikroskop altında incelenmesine dayanır.Lekenin şekli sperm hücrelerini epitel hücrelerinden ayırmayı sağlar.Sperm kuyruğunu tanımak için yeşil boya, baş kısmını tanımak içinse kırmızı boya kullanılarak lekeye bakılır.

35. 2. Prostat-Spesifik Antijen (PSA veya p30) Prostat sepisifik antijeni prostat bezi tarafından üretilen bir proteindir. PSA nın belirlendiği bu test antijen-antibody etkileşimine dayanır. .

36. Örnek svapla veya kesilerek alınır ve suya konularak çalkalanır. • Testin yapılacağı membranın test well bölümüne bu sıvı damlatılır. • Sıvı, result well kısmına doğru hareket eder.

37. Antibody membrana bağlanmış durumdaydı. • Görünür test çizgisi (T) PSA’ nın varlığını gösterir. • Diğer çizgiler ise testin tam olarak tamamlanıp tamamlanmadığını belirtir. • Pozitif Negatif Tamamlanmamış

38. TÜKÜRÜK • Ağız mukozasının dil, dudak, yanak ve damak kısmında daha küçük bezlerin salgılarının karışımıdır. • Tükürükte tiyosiyanat ve nitrit iyonları ile bazik fosfotaz ve α-amilaz enzimleri bulunur. • α-amilaz birçok vücut sıvısında bulunur ve nişastayı hidroliz eder.

39. Tükürük Lekesinin Belirlenmesi • Lekede α-amilaz enziminin yüksek oranlarda varlığının belirlenmesi analiz edilen lekenin büyük ihtimalle tükürük olduğunu gösterir.Bunun belirlenmesi için iki yöntem kullanılır. • Nişasta – İyot Testi • Phadebas Reaktifi veya Boyalı Nişasta substratları

40. Nişasta - İyot Testi • Bu testte tükürük lekesi olduğundan şüphelenilen bölgeden tükürük ekstrakte edilir ve agar jeline emdirilir, jelin içine yayılması beklenir. • Agar jelinin içinde nişasta bulunur. Eğer leke gerçekten tükürük lekesiyse α-amilaz enzimi nişastayı hidroliz edecektir. Bu hidroliz klasik nişasta-iyot reaksiyonu ile belirlenir. Nişastanın iyotla olan karakteristik reaksiyonu sonucu mavi-mor renk oluşur. • Önce Negatif veya Pozitif (tükürük)

41. 2. Phadebas Reaktifi • Bu testte ise nişasta, çözünmeyen bir kompleks oluşturmak üzere cibachron mavisi ya da procion kırmızısı gibi bir boyaya kovalent olarak bağlanmıştır. Ortamda α-amilaz enzimi varlığında boya bileşeni çözeltide serbest kalır. • Bu test için iki metot kullanılır: • Baskı testi • Tüp testi

42. Phadebas Reaktifi Baskı Testi • 1. Test edilecek olan madde yere serilir ve sprey yardımıyla ıslatılır. • 2. Test edilecek bölge phadebas kağıdıyla kaplanır ve ıslatılır. • 3. Kağıdın arkasından test edilen bölgenin sınırları çizilir. • 4. Daha iyi etkileşim sağlanması için kağıdın üzerine ağırlık konur. • 5. Kronometre tutulur ve 40 dakika boyunca izlenir. Tükürüğün olduğu bölgede mavi renklenme olur.

43. Bu test aşağıdaki aşamalara göre yapılır. • 1 2 3 • 4 5

44. Phadebas Reaktifi, Tüp Testi • Lekenin olduğu giysi(vb) küçük parçalara ayırılarak bir tüpe konur. • Su ve phadebas tabletleri eklenir, ısıtılır. • Tablet ve giysi kalıntıları santrifüjle ayrılır. • Üst kısımda kalan sıvıdaki renklenme miktarı spektrofotometre ile ölçülür.

45. Genel olarak tükürük testleri tükürük varlığını kesin olarak tespit edemezler. Çünkü amilaz birçok vücut sıvısında bulunur. Bu testler de amilazın varlığına dayandırılarak yapıldığı için yeterli değildir. • Ayrıca çok düşük miktarlardaki tükürüğü bu testlerle tespit etmek zordur. Yeterince hassas değillerdir.

46. İDRAR • İdrar, böbreklerde oluşan ve idrar yolları ile atılan bir biyolojik sıvıdır. • İdrar lekesi görsel olarak belirlenebilir. • İdrarda bulunan üre ve kreatininde önemli miktarda amin vardır. Aminlerin varlığını onaylayan presumptive kimyasal bir reaksiyonla idrarın varlığı tespit edilir.

47. Eğer idrar lekesine üreaz enzimi eklenirse ürenin bozulma reaksiyonu katalizlenir ve amonyak ortaya çıkar. Amonyak varlığı çeşitli asit-baz indikatörleri ile belirlenebilir. • Üre + H2O üreaz CO2 + 2NH3 • Ortamda pikrik asit ve zayıf baz varsa idrarda parlak-kırmızı renklenme görülür. Jaffe reaksiyonu olarak bilinen bu reaksiyon kreatinin varlığını tespit eder.

48. Aminleri saptamak için kullanılan genel yöntem p-dimetilaminocinnamaldehit (DMAC) reaksiyonudur. Bu reaksiyonda oluşan schiff bazının verdiği koyu-pembe/kırmızı renklenme ile amin tespit edilir.

49. Adli serolojistin bir olayı incelemeden önce sorması gereken temel sorular : 1. Analiz edilecek biyolojik madde kan mı, semen mi, herhangi bir vücut sıvısı mı?

50. 2. Analiz edilecek madde insana mı hayvana mı ait? Eğer hayvansa hangi hayvana ya da hayvan grubuna ait? 3. Analiz edilecek madde bulunduğunda nasıldı: sıvı, kuru, aşınmış, çürümüş veya taze? 4. Analiz edilecek madde hangi yüzeyde veya objede bulundu, maddeyi almanın ve korumanın en iyi yolu nedir?