1. 生物化学实验 CQMU 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 P、74 生物化学与分子生物学实验室 2008.09

2. 一 实验目的 • 二 实验原理 • 三 实验材料与仪器 • 四 实验步骤 • 五 注意事项 • 六 思考题

3. 一 、 实验目的 • 学习掌握电泳技术的基本原理 • 熟悉醋酸纤维薄膜电泳法分离血清 • 蛋白质的方法 • 了解血清蛋白质测定的临床意义

4. 二、电泳法的基本原理 带电质点在电场中向所带电荷相反方向泳行的现象叫电泳（Electrophoresis）。 蛋白质是兼性离子，由于不同蛋白质分子的氨基酸种类和数目组成不同，各种血清蛋白质的分子量和等电点也不相同，故在同一pH条件下，它们的电泳速度各不相同，因此可以彼此分开。

5. H＋ COOH COOH COO－ P P P COO－ P NH2 NH2 NH3＋ NH3＋ OH－ OH－ H＋ 蛋白质两性电离和等电点 pH﹤pI 带负电,向正极移 pH=pI 不显电性 不移动 pH﹥pI 带负电,向正极移

6. 血清蛋白电泳的基本原理 本实验以醋酸纤薄膜为支持物，利用血清蛋白质的等电点都低于8，在pH8.6的巴比妥缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动，经50分钟电泳后，用氨基黑10B染色，可将血清蛋白分为清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白五个区带。

7. 电泳仪 电泳槽 三、实验材料与仪器 1 器材： 血清、 醋酸纤维薄膜(8X2mm)； 常压电泳仪；水平电泳槽； 分光光度计等 分光光度计

8. 2 试剂： （1）pH8.6巴比妥缓冲液(离子强度0.07) （2）0.5%氨基黑10B染色液 （3）漂洗液:乙醇:冰醋酸:H2O =45:5:40ml （4）洗脱液：0.4 mol/L NaOH溶液

9. 四、实验步骤 • （一）准备： • 取缓冲液中浸泡的薄膜1张； • 用滤纸吸干多余水分； • 识别无光泽面； • 记下上样端的编号。

10. 1.5cm （+） （-） 无光泽面 点样线 （二）点样： 用X光片蘸血清点于薄膜条无光泽面的点样线上（距膜端1.5厘米处），使血清渗入膜内。

11. (三) 电泳： • 将薄膜点样面（无光泽面）向下，两端拉平紧贴于电泳槽架的滤纸垫上，点样端在阴极，盖上槽盖。 • 通电: 电压110-120 V，50-60 min。 • 关闭电源。

12. (四) 染色与漂洗 • 取出膜条，浸入氨基黑10B溶液中 • 染色5 min(浸透后再放第二张)。 • 取出薄膜，浸入漂洗液中漂洗3-4次 • 至背景基本无色，呈现出清晰的血 • 清蛋白电泳图谱，晾干备用.

13. 清 蛋 白 α 2 α 1 γ β 人血清蛋白电泳图 — + 人血清脂蛋白电泳图

14. (五)定量(洗脱定量法与扫描定量法) • 1 洗脱： • 取试管6支，依次编号为0（空白）、A、α1、α2、β、γ，各管中加0.4mol/L NaoH 5ml。将电泳图谱按A、α1、α2、β、γ蛋白区带剪开，分别装入相应试管中。在图谱两端无蛋白部位剪一大小与α1相同的薄膜放入空白管。反复摇动，使薄膜上染料充分洗脱在NaOH液中

15. 2 比色 • 在波长650nm，以空白管调零，读取清蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白各管的吸光度。

16. 3 计算 • 先按下式计算光吸收值总和(T): • T = A + α1 + α2 + β + γ • 再按以下算式计算各组分蛋白质的百分数 • 清蛋白 (%)＝（ A/T ）×100% • α1球蛋白(%)＝（α1/T）×100% • α2球蛋白(%)＝（α2/T）×100% • β球蛋白 (%)＝（β/T ）×100% • γ球蛋白 (%)＝（γ/T ）×100% • A/G ＝ A÷(Aα1＋Aα2＋Aβ＋Aγ)

17. 五、注意事项 • 醋酸纤维薄膜的预处理 • 点样位置及上样量 • 薄膜在槽中的摆放方向和膜面的朝向 • 电压电流的高低与分离效果 • 控制染色方法和时间

18. 六、思考题 • 为什么电泳时采用pH8.6的缓冲液？ • 与滤纸电泳比较，血清蛋白醋酸纤维 • 薄膜电泳有哪些优点？

19. 影响电泳的因素 1、质点的大小、形状、带电性质 2、溶液的pH: pH=pI; pH>pI; pH<pI 3、电压大小: 10～12V/cm长 4、电流强度: 0.4～0.5mA/cm宽 5、电渗:溶液对固定相的相对移动

20. 电泳方向: 受带电性质， 溶液的pH决定和影响. 用 途: 分离纯化蛋白质.

21. 急性肾炎 营养不良水肿 肝脾肿大 红斑狼疮 某些疾病患者血清醋酸纤维薄膜电泳结果

22. (五) 透明 将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明A液2分钟→随即转入B液1分钟→取出后将薄膜平贴于玻璃板上3～5分钟→薄膜完全透明。膜与玻璃板间不能有气泡。 干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫描,长期保存不褪色。

23. 透明（P、76） • 扫描 用光密度扫描分析仪，扫描透明 过的电泳薄膜，便可得出电泳曲线，即距离—光密度曲线（图）。 • 求积定量 算出曲线每个峰的面积与总面积的百分比，就是各区带蛋白质占血清总蛋白的百分比。 2 扫描定量法

25. Let's begin！